Thèse Spécificités Fonctionnelles des Exoenzymes Bactériens de Type Exoy en Tant que Purinyl- et Pyridylyl Cyclases Études Biochimiques et Structurales. H/F - Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Laboratoire de recherche : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
Direction de la thèse : Louis RENAULT ORCID 000000031722074X
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-23T23:59:59

L'AMP cyclique (cAMP) et le GMP cyclique (cGMP) sont des seconds messagers bien établis dans la signalisation cellulaire. En revanche, les nucléotides cycliques pyrimidiques non canoniques cUMP et cCMP restent mal compris, malgré des preuves claires de leur présence dans les cellules eucaryotes depuis plus de 15 ans [1]. Ce projet de thèse combine des approches biochimiques et structurales pour étudier des cyclases pyrimidiques bactériennes et leurs effecteurs, afin d'améliorer notre compréhension de la signalisation cUMP/cCMP et de soutenir le développement de biosenseurs dédiés.
Les cyclases pyrimidiques bactériennes Pycsar (PycC), réparties en cinq clades, ont récemment été identifiées comme des composants clés de systèmes de défense anti-phages appelés système Pycsar (pyrimidine cyclase system for antiphage resistance) [2]. Les PycC synthétisent du cUMP ou du cCMP dans les bactéries infectées, activant des effecteurs qui déclenchent leur mort cellulaire lors d'une attaque par un phage. Toutefois, leurs propriétés enzymatiques, ainsi que leurs mécanismes d'activation et de régulation, restent largement inexplorés. En parallèle, les exotoxines de type ExoY, des nucléotidyl cyclases (NC) apparentées, sont des facteurs de virulence bactérienne qui, une fois injectés dans les cellules eucaryotes, sont activés par l'actine de l'hôte et génèrent de fortes quantités de nucléotides cycliques puriques (cAMP, cGMP) et pyrimidiques (cUMP, cCMP), perturbant les voies de signalisation de l'hôte [3-4]. La cytotoxicité et le rôle des toxines ExoY dans différentes infections bactériennes, ainsi que les fonctions du cUMP et du cCMP dans les cellules eucaryotes, demeurent mal compris.
Caractérisations enzymatiques : Des enzymes PycC et ExoY-like représentatives, issues de bactéries sélectionnées (p. ex. P. aeruginosa, E. coli, Vibrio vulnificus, Aeromonas schubertii), seront caractérisées sur le plan biochimique. Un test fluorescent au terbium-norfloxacine (TBN) sera optimisé afin de suivre en temps réel la conversion de nucléotides triphosphates puriques/pyrimidiques en nucléotides cycliques. Ce test permettra d'évaluer l'effet de cofacteurs, du pH et de l'état oligomérique sur l'activité, et d'identifier d'éventuels cofacteurs physiologiques des PycC. Si la sensibilité est suffisante, il servira à déterminer les spécificités de substrat et les propriétés enzymatiques de differents orthologues PycC et ExoY. Il sera aussi utilisé par des collaborateurs (chimistes du campus) pour cribler des bibliothèques de petites molécules à la recherche d'inhibiteurs des toxines NC de type ExoY, qui seront ensuite a caractériser.
Études structurales : Sur la base des données biochimiques, des analyses structurales à résolution atomique de PycC et d'orthologues ExoY seront menées par cristallographie aux rayons X (encadrement LR) et/ou cryo-microscopie électronique (encadrement PDC), afin d'élucider les bases moléculaires de la sélectivité de substrat et des mécanismes catalytiques. La dynamique conformationnelle et les états on/off d'un effecteur Pycsar lors de la liaison au cUMP/cCMP seront également étudiés.
Développement de biosenseurs cUMP/cCMP : Guidé par les données structurales ou des modèles prédits d'effecteurs Pycsar dépendants du cUMP/cCMP, le projet initiera l'étude in vitro et le développement de biosenseurs FRET spécifiques du cUMP et du cCMP, afin de suivre a plus long terme leur production et leur dynamique dans les cellules.
Perspectives : Une meilleure compréhension de la synthèse sélective du cUMP/cCMP par les NC PycC et ExoY, associée au développement de biosenseurs FRET spécifiques, contribuerait à faire progresser l'étude des voies de signalisation cUMP/cCMP, à répondre à l'enjeu de l'antibiorésistance (PycC), et à mieux caractériser les toxines ExoY, tout en évaluant leur potentiel comme cibles thérapeutiques.

Cyclic AMP (cAMP) and cyclic GMP (cGMP) are well-established second messengers in cellular signaling. By contrast, the non-canonical pyrimidine cyclic nucleotides cUMP and cCMP remain poorly understood, despite clear evidence of their presence in eukaryotic cells over the past 15 years [1]. This PhD project combines biochemical and structural approaches to investigate bacterial pyrimidyl cyclases and their effectors, with the aim of advancing our understanding of cUMP/cCMP signaling and supporting the development of biosensors for these molecules.
Bacterial Pycsar pyrimidine cyclases (PycC), classified into five clades, were recently identified as key components of phage defense systems known as the Pycsar system (pyrimidine cyclase system for antiphage resistance) [2]. PycCs synthesize cUMP or cCMP in infected bacteria, activating effectors that trigger cell death upon phage attack. However, their enzymatic properties and mechanisms of activation and regulation remain largely unexplored. In parallel, ExoY-like nucleotidyl cyclase (NC) exotoxins are bacterial virulence factors that, once injected into eukaryotic cells, are activated by host actin to generate high levels of purine (cAMP, cGMP) and pyrimidine (cUMP, cCMP) cyclic nucleotides, thereby perturbing host signaling pathways [3-4]. The cytotoxicity and contribution of ExoY toxins to bacterial infections, as well as the roles of cUMP and cCMP in eukaryotic cells, remain poorly understood.

This PhD project combines biochemical and structural approaches to study atypical bacterial pyrimidyl cyclases and their effectors. Its goals are to deepen our understanding of cUMP/cCMP signaling, support the development of biosensors for these cyclic nucleotides, and provide structural insights into the enzymatic specificities of ExoY-like nucleotidyl cyclase toxins found in many pathogenic proteobacteria. In the long term, this work aims to elucidate the cytotoxic specificities of these toxins and clarify their roles in diverse bacterial infections.

To address the objectives described above, the project will rely on the following main technical approaches:
--Bioinformatic and structural analyses
--Recombinant protein expression and purification, including protein labeling for biophysical studies
--Protein engineering, including the design of chimeric proteins to stabilize transient intermediates along the cyclase reaction catalyzed by actin-activated bacterial NC toxins, and to develop cUMP/cCMP-specific FRET biosensors
--Functional biochemical and biophysical analyses (fluorimetric enzymatic assay, actin polymerization kinetics, actin self-assembly assays, affinity measurements, hydrodynamic characterization and modeling)
--Optimization of in vitro colorimetric assays compatible with high-throughput screening of small-molecule libraries to identify selective toxin inhibitors, in collaboration with local chemists (ICSN, on campus) and partners at Institut Pasteur (Paris, France). If time permits, hits will be evaluated using functional and toxicity assays and supported by structural studies to guide iterative optimization of inhibition mechanisms.
--Protein crystallization and structure determination by X-ray crystallography and electron microscopy.

Master en biochimie, biologie structurale, biophysique, biologie ou microbiologie, avec d'excellents résultats académiques. Le/la candidat(e) devra avoir un bon esprit d'équipe et un fort intérêt pour l'étude in vitro des interactions macromoléculaires, de leur régulation, et des relations structure-fonction des protéines.

Toute expérience de recherche supplémentaire en lien avec le projet sera un atout (analyses bioinformatiques, biochimie, biophysique, biologie moléculaire, structurale ou cellulaire). Ces expériences et vos résultats académiques devront être clairement présentés dans le dossier de candidature. Merci d'indiquer également les noms et coordonnées de vos encadrants de stage/formation, avec les périodes concernées.