Thèse Décrypter les Mécanismes Précoces d'Immunosurveillance des Cellules Nk Contre les Cellules Prénéoplasiques Afin d'Identifier de Nouvelles Cibles Thérapeutiques H/F - Université Claude Bernard Lyon 1

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1
École doctorale : CanBioS - Cancérologie, Biologie, Santé de Lyon
Laboratoire de recherche : CRCL - CENTRE DE RECHERCHE EN CANCÉROLOGIE DE LYON
Direction de la thèse : Nathalie BENDRISS-VERMARE ORCID 0000000287713585
Début de la thèse : 2026-09-01
Date limite de candidature : 2026-05-11T23:59:59

Le cancer du sein demeure la première cause de mortalité par cancer chez la femme. Malgré les progrès récents, les immunothérapies actuelles, principalement centrées sur les lymphocytes T, montrent un bénéfice limité dans ce cancer. Or, des données émergentes suggèrent que les cellules NK jouent un rôle déterminant dans les toutes premières étapes de l'immunosurveillance antitumorale, notamment lors de la transition entre tissu sain, lésion prénéoplasique et tumeur invasive. Cependant, les mécanismes précoces permettant aux cellules NK de détecter et contrôler les cellules prénéoplasiques restent largement méconnus.
Ce projet de thèse vise à caractériser de manière intégrée, dynamique et multimodale les interactions entre les cellules NK et les cellules épithéliales prénéoplasiques dans le cancer du sein, afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant soit d'intercepter la progression tumorale, soit de restaurer une immunité NK efficace à des stades avancés.
S'appuyant sur un modèle murin de tumeur mammaire spontanée (BRCA1/p53) et sur un important jeu de données préliminaires (scRNA-seq de >120 000 cellules, transcriptomique spatiale, cytométrie spectrale), le projet s'articule autour de trois objectifs principaux :
1-Caractériser la dynamique des cellules NK au cours de la tumorigenèse, en combinant analyses transcriptomiques, cytométrie spectrale, tests fonctionnels et modélisation in vitro/ex vivo.
2-Identifier les interactions ligand/récepteur qui gouvernent l'activation des cellules NK dans les lésions prénéoplasiques, via l'intégration d'analyses spatiales et d'inférences cellulaires, puis valider ces interactions chez la souris et chez l'humain.
3-Démontrer la pertinence biologique des voies d'immunosurveillance identifiées, par validations fonctionnelles in vitro et in vivo, notamment via le blocage ciblé d'interactions clés ou via des modèles murins génétiquement modifiés.

Ce travail mobilise des technologies de pointe disponibles au CRCL (single-cell RNA-seq, transcriptomique spatiale Xenium, cytométrie spectrale, organoïdes murins, modèles murins transgéniques). Il s'inscrit dans une expertise établie de l'équipe en immunosurveillance dans l'immunité innée.

Retombées attendues :
Le projet fournira une cartographie sans précédent des mécanismes précoces d'immunosurveillance NK et devrait permettre l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour activer ou restaurer les fonctions NK, ouvrant la voie à des stratégies innovantes d'immunointerception ou d'immunothérapie dans le cancer du sein.

Le cancer du sein (CS) est le cancer le plus fréquent chez la femme en termes d'incidence [1]. Malgré une amélioration de sa prise en charge, il reste cependant la première cause de mortalité par cancer chez la femme. Les nouvelles thérapies mobilisant le système immunitaire (immunothérapies), basées sur le ciblage des points de contrôle immunitaires des lymphocytes T, montrent un bénéfice limité dans le CS malgré la présence d'un infiltrat immunitaire de bon pronostic [2], soulignant l'importance d'identifier des cibles alternatives d'immunothérapie. Le dialogue entre le système immunitaire et les cellules cancéreuses est un processus dynamique qui évolue au cours du développement tumoral. En effet, ces interactions protègent du développement tumoral au stade précoce (immunosurveillance) mais sont altérées et/ou modifiées à des stades plus tardifs, conduisant à un échappement immunitaire (immunosubversion) et à la progression du cancer. Les cellules de l'immunité innée agissent en première ligne de défense lors d'une réponse immunitaire. Parmi celles-ci, les cellules Natural Killer (NK) luttent contre le développement tumoral grâce à leurs fonctions effectrices et auxiliaires que sont la cytotoxicité et la production d'IFN-. En effet, chez l'homme une faible activité cytotoxique des cellules NK dans le sang périphérique est associé à risque accru de développer un cancer [3] et la présence de cellules NK au sein de la tumeur est associée à un bon pronostic [4]. Des expériences de déplétion des cellules NK in vivo ont permis de monter qu'elles limitent le développement de lignées CMH-I déficientes et protègent contre le développement de fibrosarcome induit par methylcholanthrene [5,6]. Chez l'homme, les données de la littérature indiquent que les cellules NK humaines sont capables d'infiltrer les tumeurs mammaires à des stades précoces [7] (carcinome in situ, DCIS) et cette infiltration est associée à un bon pronostic [4] suggérant l'existence de voies d'immunosurveillance impliquant les cellules NK dans le CS. Cependant, à des stades plus tardifs, la tumeur met en place des mécanismes d'immunosubversion, conduisant à une incapacité des cellules NK à détecter et éliminer les cellules tumorales en raison d'une altération de leur phénotype et de leurs fonctions [7]. La détection des cellules tumorales par les cellules NK implique des interactions entre des ligands (L) (exprimés par les cellules tumorales) et des récepteurs (R) (exprimés par les cellules NK) (L/R). Malgré l'importance de l'interaction NKG2D/NKG2DL [8], la majorité des études décrivant le rôle protecteur des cellules NK contre le développement tumoral ont été réalisées à des stades tardifs de la tumorigenèse et dans des modèles artificiels [9]. Ainsi, les évènements précoces qui permettent la détection des cellules précancéreuses/prénéoplasiques par les cellules NK et leur dynamique au cours du développement tumoral restent à ce jour encore mal compris.

Résultats préliminaires :
Notre laboratoire a mis en place un modèle de tumeur mammaire spontanée et sporadique [10] (BLG-cre BRCA1f/f p53+/-) dont la cinétique et les stades de développement tumoraux sont bien caractérisés et fidèles à la pathologie humaine (Fig.1A). Ce modèle nous permet d'avoir accès à des tissus sains (H issus de souris contrôles littermate BRCA1f/f p53+/+, prénéoplasiques (P = normal-like, adénose et hyperplasie) issus de souris BLG-cre BRCA1f/f p53+/- non porteuses de tumeurs, et tumoraux (T = carcinome invasif) issus de souris BLG-cre BRCA1f/f p53+/- porteuses de tumeurs. Une étude de séquençage à l'échelle de la cellule unique (single cell RNA-sequencing, scRNA-seq) des cellules épithéliales triées et de l'infiltrat inné (cellules myéloïdes, dendritiques et NK) à partir de tissus mammaires H/P/T (n > 120000 cellules totales) (Fig.1B et C) nous a permis d'identifier des cellules épithéliales prénéoplasiques (n = 284) (Fig.1D et E) et différents clusters de cellules NK (n = 12) et autres cellules innées, dont les proportions varient selon les stades, avec un enrichissement des clusters NK 0, 1 et 3 au stade P (Fig.2A et B). Nous avons montré un enrichissement transitoire en cellules NK parmi les cellules immunitaires infiltrantes (CD45+) dans les glandes mammaires au stade P par rapport aux stades H et T (Fig.2C et D), associé à des fonctions de dégranulation (CD107a) et de production de cytokines (TNF-a) (Fig.2E), montrant que le stade P s'accompagne d'une mobilisation accrue et fonctionnellement active des cellules pNK au sein du microenvironnement mammaire, susceptible de contribuer aux mécanismes locaux de surveillance et de contrôle tumoral.

L'objectif de la thèse consiste donc à explorer en profondeur et de façon dynamique, in vivo chez la souris et in situ chez l'homme, le dialogue entre les cellules NK et les cellules épithéliales saines (H=Healthy), prénéoplasiques (P) et tumorales (T) dans le CS. A travers une analyse intégrée, non biaisée, et spatiale, nous démontrerons l'importance et l'impact de la dynamique de ces interactions sur le développement du CS. Ce projet sera articulé autour de 3 objectifs : 1) Décrire les caractéristiques moléculaires, phénotypiques et fonctionnelles des pNK (NK au stade prénéoplasique) aux différents stades du développement tumoral ; 2) Décrypter le dialogue spatio-temporel entre les cellules épithéliales prénéoplasiques, les pNK et les autres cellules immunitaires ; 3) Identifier et valider les mécanismes d'immunosurveillance précoce pour maintenir ou restaurer le contrôle immunitaire médiée par les cellules pNK. Ce projet s'inscrit dans un effort global de l'équipe visant à caractériser les voies d'immunosurveillance dans différentes populations de l'immunité innée dans la perspective d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, soit pour réactiver des voies d'immunosurveillance dans les stades avancés soit pour intercepter le développement tumoral.

-Objectif 1 : Caractérisation de la dynamique des cellules NK au cours du développement tumoral
Le premier objectif de ce projet est de caractériser de manière intégrée et multimodale les cellules NK au cours de la tumorigenèse, en combinant analyses transcriptomiques, approches fonctionnelles, modélisation in vitro et validation in vivo afin de comprendre leurs dynamiques, leurs interactions avec le microenvironnement et leur impact sur la progression tumorale.

1.1) Exploiter notre jeu de données de single cell RNAseq pour caractériser en profondeur les pNK
Nous utiliserons le jeu de données scRNAseq déjà généré au sein de l'équipe à partir d'échantillons de tissus H, P et T, afin de réaliser une caractérisation approfondie des cellules NK au cours de la tumorigenèse. Nous identifierons les gènes différentiellement exprimés (DEGs) entre les cellules NK aux différents stades de développement tumoral (H, P, T) pour définir des signatures géniques spécifiques. À partir de cette analyse des DEGs, nous mettrons également en évidence les voies de signalisation modulées (activées ou diminuées) dans les cellules NK issues de tissus H, P et T, en interrogeant des bases de données publiques telles que MsigDB, KEGG ou Gene Ontology. Enfin, nous révélerons les états transitionnels des cellules NK et épithéliales au cours de la progression tumorale grâce à des analyses de trajectoire (Slingshot [11]) et de vélocité (scVelo [12]). Ceci permettra de caractériser les changements dynamiques des populations NK et épithéliales ainsi que de leurs états fonctionnels au cours de la croissance tumorale. Nous caractériserons également les cellules épithéliales, notamment prénéoplasiques afin d'identifier les ligands et récepteurs qu'elles expriment et qui pourraient être impliqué dans l'immunosurveillance.
Résultats attendus : Avec ces analyses transcriptomiques, nous nous attendons à identifier des sous-populations de NK phénotypiquement différentes et impactées par leur environnement (H, P et T).

1.2) Caractériser le phénotype et la fonction des pNK par cytométrie en flux (FACS) spectrale
Nous avons développé un panel de cytométrie spectrale permettant d'identifier les NK et de les caractériser phénotypiquement et fonctionnellement (marqueurs d'activation, d'épuisement, récepteurs activateurs, inhibiteurs, cytokines..., n>25 marqueurs). Ce panel sera appliqué à des échantillons de glandes mammaires (H, P et T). Nous évaluerons également la capacité des pNK à répondre à des stimulations in vitro par des cytokines (IL-12, IL-15, IL-18) et des cibles (lignée YAC-1 ou organoïdes P vs T issu du modèle BRCA1, voir détails point 1.3), en comparaison à des NK isolées de tissus H et T. Nous développons actuellement un protocole pour enrichir les glandes mammaires H, P, T en cellules NK (>75% de pureté avec élimination des lymphocytes T). Nous évaluerons la capacité des NK à dégranuler (CD107a) et produire des cytokines (IFN-g/TNF-a/CCL3/CCL5).
Résultats attendus : Cette analyse en cytométrie permettra de valider à l'échelle protéique les résultats des analyses en scRNAseq ainsi que le phénotype et la fonction des pNK.

1.3) Evaluer l'influence des signaux environnementaux sur les NK à travers des expériences de modélisation in vitro
Nous constituons actuellement deux biobanques : une biobanque de surnageants de dilacération des tissus H, P, T et une biobanque d'organoïdes H, P, T, cultivés à long terme et de « haute qualité », à partir de tissus prélevés sur les souris transgéniques. Nous avons également mis au point un protocole pour isoler des NK à partir de splénocytes.
Nous évaluerons l'impact des surnageants et des organoïdes préparés à partir des tissus (H, P et T) sur les cellules NK isolées à partir de splénocytes. Leur activation (phénotype et production de cytokines/chimiokines) ainsi que leur capacité à proliférer et éliminer les cellules cibles seront évaluées par cytométrie en flux et par tests de cytotoxicité en temps réel (live killing assay). De plus, nous évaluerons la capacité des surnageants à faire migrer les NK dans des expériences de transwell in vitro.
Résultats attendus : Ces expériences permettront notamment de déterminer si l'activation des NK au stade P est liée aux sécrétions du micro-environnement ou aux interactions avec les cellules épithéliales.

1.4) Evaluer in vivo le rôle des NK sur la progression tumorale dans le modèle spontané
Afin de confirmer le rôle antitumoral des cellules NK au stade P dans notre modèle murin de tumeurs spontanées, nous avons pour objectif de dépléter les cellules NK à un stade précoce et de mesurer l'impact de cette déplétion sur la cinétique de développement tumoral et la composition du microenvironnement tumoral (par FACS). La déplétion des cellules NK sera réalisée par injections répétées d'anticorps antiNK1.1 toutes les 3 semaines pendant 4 mois, comme validé dans des expériences préliminaires. Le croisement avec des souris Ncr1-DTR (disponibles au CIRI Lyon) permettrait quant à lui de s'affranchir de l'utilisation d'anticorps et d'obtenir une déplétion pérenne des NK.
Résultats attendus : Démontrer l'importance des cellules NK dans la protection contre le développement tumoral.

-Objectif 2 : Identification et sélection des interactions impliquées dans l'immunosurveillance des lésions prénéoplasiques par les pNK
Ce deuxième objectif vise à identifier les interactions cellulaires qui gouvernent l'activation des pNK au sein du tissu prénéoplasique, en intégrant analyses spatiales, inférence ligand/récepteur et validations protéiques y compris chez l'Homme.

2.1) Décrypter la localisation in situ des pNK et leurs interactions avec les cellules prénéoplasiques et les autres cellules immunitaires grâce à l'analyse transcriptomique spatiale
L'objectif de cette tâche est d'élucider la distribution spatiale et les interactions cellulaires des cellules pNK au sein du tissu P, ainsi que de replacer dans leur contexte spatial les résultats obtenus par l'analyse scRNAseq (T1.1). Nous exploiterons les données de transcriptomique spatiale déjà générées dans l'équipe (n=4-5 pour chaque stade H, P et T). Nous utiliserons une méthodologie de déconvolution des signatures géniques afin d'identifier les différentes populations cellulaires (cellules prénéoplasiques, cellules pNK et autres cellules immunitaires), ce qui nous permettra de mettre en évidence la proximité entre pNK, cellules prénéoplasiques et cellules immunitaires voisines et d'identifier les voies biologiques enrichies dans les zones riches en pNK (comme l'analyse d'enrichissement de voies réalisée en T1.1).
Résultats attendus : La validation de la proximité spatiale entre les pNK et les cellules prénéoplasiques est une étape importante pour rationaliser leurs capacités cytotoxiques apparentes. Leurs capacités d'infiltration mais également le dialogue avec les autres cellules immunitaire sont des informations cruciales.

2.2) Inférer les couples ligands(L)/récepteurs(R) en fonction des interactions cellulaires spatiales
En intégrant les données de scRNAseq et l'analyse de transcriptomique spatiale (collab. J Hausser Karolinska Institute et M Claassen Tubingen University), nous étudierons les interactions entre pNK et cellules prénéoplasiques, ainsi qu'entre pNK et autres cellules immunitaires, afin d'identifier des mécanismes potentiels de régulation immunitaire et de communication cellulaire au stade P, par comparaison aux 2 autres stades. Pour cela, nous réaliserons une analyse ligand-récepteur en utilisant les packages CellPhoneDB [13] ou LIANA [14] qui permettent de prédire les couples L/R impliqués dans l'interaction entre 2 cellules à partir de données de sc-RNAseq.
Résultats attendus : Cette étape devrait nous permettre de mettre en évidence des couples L/R à l'échelle transcriptomique responsable de l'activation des pNK contre les cellules prénéoplasiques.

2.3) Valider la présence des couples L/R à l'échelle transcriptomique chez l'Homme et protéique chez la souris et l'Homme (FACS / mIF)
L'expression des couples L/R identifiés chez la souris en 2.2 seront ensuite validés chez l'Homme dans différents jeux de données publiques de i) scRNAseq issus de patientes CS mutés BRCA1/2 incluant du tissu prénéoplasique et tumoral (ArrayExpress Database : E-MTAB-13664) [13] et ii) bulk RNAseq de patientes CS TCGA [15].
Les couples L/R les plus pertinents seront ensuite validés à l'échelle protéique sur des échantillons frais dissociés provenant de tissus à différents stades du développement tumoral (H, P et T) dans notre modèle murin transgénique par cytométrie en flux spectrale et sur des tissus FFPE chez l'homme par multiplex IF.
Résultats attendus : Cette approche est cruciale pour valider l'impact translationnel du projet. Confirmer l'existence de couples L/R chez l'humain demeure une étape indispensable à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

-Objectif 3 : Exploration biologique des voies d'immunosurveillance des cellules pNK permettant de restaurer le contrôle des cellules prénéoplasiques.
Il s'agira de démontrer la pertinence biologique des couples L/R identifiés chez la souris et observés chez l'Homme (n=5), en validant leur rôle dans l'activation des cellules NK et leur capacité à contrôler le développement tumoral dans des modèles in vitro et in vivo.

3.1) Validation fonctionnelle des couples ligands/récepteurs in vitro chez l'homme et la souris
Comme en 2.2/2.3, les cellules NK isolées de tissus H ou P seront cultivées avec des organoïdes mammaires P ou T issus du modèle murin BRCA1/p53 en présence d'anticorps bloquants des couples L/R identifiés. Nous analyserons l'impact du ciblage sur la survie/mort des cellules épithéliales grâce à un marquage annexine V/PI. En parallèle nous analyserons le phénotype et l'activation des cellules NK ainsi que leurs fonctions par cytométrie en flux. L'impact fonctionnel des interactions validées dans les modèles murins pourra être confirmé chez l'Homme dans un modèle épithélial mammaire P de stress oncogénique inductible (HMEC-RASG12D) établi au laboratoire [16].
Résultats attendus : Le blocage des L/R identifiés précédemment devrait entrainer une diminution de l'efficacité des cellules NK à éliminer les cellules prénéoplasiques/tumorales.

3.2) Validation fonctionnelle des couples ligands/récepteurs in vivo
Pour valider in vivo les cibles identifiées, nous injecterons des organoïdes (P ou T) dans la glande mammaire de souris invalidées (KO) pour les voies d'immunosurveillance ou de souris sauvages traitées par anticorps bloquants. Nous mesurerons l'impact sur la croissance tumorale, l'état d'activation des cellules NK et la composition du microenvironnement tumoral (par cytométrie en flux).
Résultats attendus : valider la causalité : la perturbation d'un axe L/R devrait empêcher la destruction des cellules P par les NK, et identifier les candidats les plus efficaces dans l'immunosurveillance.

Faisabilité du projet :
-Ressources biologiques : NK purifiées (rates et glandes mammaires), organoïdes, surnageants de tissus mammaires, souris transgéniques (BLG-cre ; BRCA1f/f ; p53+/-), lignées de cellules cibles (YAC1).
-Données : Données de scRNAseq et de spatial transcriptomique dans le modèle murin déjà disponibles, jeux de données publiques de scRNAseq humain déjà récupérés dans l'équipe.
-Technologies disponibles : Accès aux plateformes CLB/CRCL : pathologie (Bond RX (Leica) pour l'immunofluorescence multiplex spectrale (mIF), cytométrie en flux spectrale (FACS) (Opteon), génomique (Xenium 10X (transcriptomique spatiale), 10X Genomics Chromium (single-cell RNAseq)).
-Protocoles : Purification cellulaire, Panels 7 couleurs pour mIF, Panel pan-immun >25 couleurs pour FACS déjà en place.
-Expertises : Notre équipe a développé une expertise en interne avec 4 doctorants/post-doctorants et l'arrivée récente d'un chercheur CNRS bioinformaticien dans l'équipe, qui fourniront au candidat un accompagnement pour les analyses computationnelles. De plus, ce dernier bénéficiera d'interactions avec la plateforme de bioinformatique au CRCL qui est partenaire de nombreux projets portés par notre équipe. Enfin, le candidat a déjà identifié des formations en analyses de données OMICS et sur le logiciel R pour pouvoir mener ces analyses bioinformatiques avec plus d'autonomie.

-Profil :
Master 2 en immunologie ayant déja réalisé des stages pratiques dans le domaine de l'immuno-oncologie

-Connaissances :
- Connaissances approfondies en immunologie, cancérologie et immunothérapies

-Compétences opérationnelles / Savoir-faire :
- Biologie cellulaire : culture cellulaire notamment modèles 3D, isolement cellulaire à partir de tissus
- Technique d'immunologie : dosages ELISA/MSD, cytométrie en flux multiparamétrique spectrale
- Techniques d'analyses in situ : Immunohistochimie / Immunofluorescence
- Analyses de données : maitrise des logiciels de cytométrie en flux FlowJo, SpectroFlo et Novoexpress, d'analyses d'images Phenochart et Halo, d'analyses statistiques et de visualisation GraphPad PRISM
- Rédaction de documents scientifiques
- Développement de nouvelles techniques et rédaction de (nouveaux) protocoles expérimentaux

-Compétences comportementales / Aptitudes :
- Autonomie
- Sens de l'organisation
- Rigueur
- Polyvalence
- Capacité de raisonnement analytique (analyse, interprétation et présentation des résultats)
- Développement d'un esprit critique et de synthèse
- Recherche bibliographique pour faire évoluer les questions ou identifier de nouvelles pistes (analyse d'articles)
- Engagement dans la vie de laboratoire (participation à la vie quotidienne)
- Sens relationnel