Thèse Implication de Zeb1 dans la Localisation Extra-Ganglionnaire des Lymphomes à Grandes Cellules B H/F - Université Claude Bernard Lyon 1

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1
École doctorale : CanBioS - Cancérologie, Biologie, Santé de Lyon
Laboratoire de recherche : CRCL - CENTRE DE RECHERCHE EN CANCÉROLOGIE DE LYON
Direction de la thèse : Isabelle COSTE ORCID 0000000298204452
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-04-30T23:59:59

Ce projet de thèse vise à comprendre les mécanismes responsables du tropisme extra-ganglionnaire des lymphomes à grandes cellules B (LBCL), en particulier ceux caractérisés par la mutation MYD88L265P. Les LBCL constituent le sous-type le plus fréquent des lymphomes non hodgkiniens et présentent une forte hétérogénéité clinique et moléculaire. Les formes extra-ganglionnaires, notamment cérébrales, sont associées à un pronostic défavorable, avec des taux de rechute élevés et une survie réduite.

La mutation MYD88L265P, fréquemment observée dans les formes extra-ganglionnaires, entraîne une activation constitutive de la voie NF-B, favorisant l'expression de gènes impliqués dans la migration et l'adhésion cellulaire. Ce processus suggère une reprogrammation transcriptionnelle conférant aux cellules tumorales des propriétés accrues de plasticité, d'invasion et de « homing ».

Nos résultats préliminaires montrent une surexpression du facteur de transcription associé à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), ZEB1, dans les lignées et biopsies de LBCL porteurs de MYD88L265P, contrairement aux formes non mutées. Nous avons démontré que cette surexpression est dépendante de l'activation de la voie MYD88/NF-B, suggérant un lien direct entre cette voie et l'agressivité tumorale.

Le projet repose sur l'hypothèse que MYD88L265P induit un programme transcriptionnel NF-B-dépendant induisant ZEB1 favorisant ainsi la plasticité, la migration et l'adaptation des cellules tumorales à des niches extra-ganglionnaires, en particulier le système nerveux central (SNC).
Ce projet se divise en trois axes. Le premier vise à valider le lien entre MYD88L265P et ZEB1 via l'analyse d'une large cohorte d'échantillons de patients. Nous décrypterons également les mécanismes moléculaires sous-jacents en étudiant notamment les différentes voies de signalisation impliquées dans la progression tumorale des LBCL. Le deuxième axe explore le rôle fonctionnel de ZEB1 dans la motilité cellulaire et le tropisme cérébral dans des modèles d'organoïdes cérébraux et de xénogreffes murines. Le troisième axe analyse l'impact de la surexpression de ZEB1 sur le microenvironnement et les interactions cellulaires avoisinantes. Cette analyse, menée par transcriptomique spatiale sur des biopsies de patients, permettra d'identifier des signatures de motilité et/ou d'adaptabilité associées à ZEB1.

Ce projet permettra d'élucider les bases moléculaires du tropisme extra-ganglionnaire et de mieux comprendre le rôle de la plasticité tumorale dans la dissémination de la maladie. À terme, il pourrait conduire à l'identification de nouveaux biomarqueurs prédictifs d'une évolution extra-ganglionnaire cérébrale secondaire, et ouvrir des perspectives thérapeutiques ciblant l'axe MYD88/NF-B/ZEB1, contribuant ainsi à améliorer la prise en charge des patients atteints de formes agressives de lymphomes.

Les lymphomes constituent un ensemble hétérogène de néoplasies hématologiques dérivées des lignées B, T ou NK, se développant majoritairement au sein des ganglions lymphatiques. Parmi eux, le lymphome diffus à grandes cellules B (LBCL) représente le sous-type le plus fréquent, correspondant à 30 à 40% des lymphomes non hodgkiniens dans le monde, avec environ 6 000 nouveaux cas annuels en France (1). Malgré une morphologie caractérisée par une prolifération diffuse de grandes cellules B matures, le LBCL est une maladie hétérogène sur les plans cliniques, moléculaire et évolutif. Afin de mieux appréhender cette diversité plusieurs systèmes de classification ont été élaborés. Les approches les plus robustes reposent sur l'analyse du transcriptome tumoral (classification selon la cellule d'origine, COO) et sur le profil mutationnel (classification LymphGene) (2). Sur la base du stade de différenciation des cellules tumorales, la classification OMS 2022 distingue trois catégories : LBCL de type centre germinatif (GCB), de type cellules B activées (ABC) et formes non classées. La classification génétique proposée par Schmitz et al. affine cette stratification en définissant quatre sous-types moléculaires : MCD (mutations MYD88L265P et CD79B), BN2 (BCL6, NOTCH2), N1 (NOTCH1) et EZB (EZH2, CCL2) (3). Parmi ces sous-types, le sous-type MCD se distingue par un pronostic particulièrement sombre. Cette agressivité est en partie liée à son tropisme extra-ganglionnaire marqué : les LBCL de sous-type MCD présentent une fréquence élevée de localisations extranodales, notamment cérébrales (4). De façon générale, les LBCL à localisation extra-ganglionnaire, qu'ils soient cutanés de type « jambe », testiculaires ou primitifs/secondaires du système nerveux central, sont associés à des taux de rechute élevés et à une survie réduite. Pourtant, les mécanismes biologiques qui permettent aux cellules tumorales de proliférer en dehors du tissu hématopoïétique restent largement méconnus. Sur le plan moléculaire la mutation oncogénique MYD88L265P est retrouvée dans 70% des LBCL extra-ganglionnaires (3,5,6). Des études mécanistiques montrent qu'elle induit une activation constitutive de NF B et augmente l'expression de gènes impliqués dans l'adhésion et la migration (notamment CD44 et LGALS3), suggérant une reprogrammation des voies contrôlant motilité et tropisme tissulaire (7). Dans les carcinomes, ce type de reprogrammation est associé à la transition épithelio-mésenchymateuse (EMT), un processus gouverné par des facteurs de transcription (EMT-TFs), des familles ZEB, SNAI et TWIST, qui contrôlent la plasticité cellulaire et confèrent des propriétés invasives (8). Au-delà de leur rôle dans l'invasion et la migration, ces facteurs influent sur de multiples processus cellulaires : différenciation, prolifération, réponse aux dommages de l'ADN, acquisition de caractéristiques de type cellules souches et mécanismes de survie (9,10). Les EMT-TFs exercent ainsi un impact sur l'ensemble de la progression tumorale, de l'initiation aux stades avancés. Si les EMT-TFs ont déjà été impliqués dans l'hématopoïèse normale, notamment dans la lignée érythrocytaire, leur participation potentielle dans la lymphomagenèse reste peu explorée (11). Par exemple, Lemma et al. ont rapporté l'expression de TWIST, ZEB1 et SLUG dans le LBCL, ZEB1 étant associé à un pronostic défavorable, tandis que l'expression cytoplasmique de SLUG corrélait avec une évolution clinique plus favorable (12). Ces observations suggèrent que bien qu'il ne puisse s'agir d'une EMT au sens strict dans le contexte hématopoïétique, les EMT-TFs, en particulier ZEB1, pourraient participer à une reprogrammation transcriptionnelle favorisant le tropisme extra-ganglionnaire des LBCL.
Nous posons ainsi l'hypothèse que l'activation constitutive de la signalisation MYD88/NF-B, caractéristique du sous-type MCD, pourrait moduler l'expression d'EMT-TFs et contribuer au tropisme extranodal et à l'agressivité clinique des LBCL.

Le projet de thèse a pour objectif principal d'élucider les mécanismes moléculaires responsables du tropisme extra-ganglionnaire des lymphomes à grandes cellules B (LBCL), en particulier dans le contexte de la mutation MYD88L265P. Plus spécifiquement, il vise à démontrer le rôle fonctionnel de l'axe MYD88/NF-B/ZEB1 dans la reprogrammation transcriptionnelle des cellules tumorales, conduisant à une augmentation de leur plasticité, de leur motilité et de leur capacité d'adaptation à un environnement tel que le système nerveux central (SNC).
Le projet comprend l'analyse de cohortes de de patients atteints de LBCL et traités dans les essais du LySA (Lymphome Study Association), afin d'évaluer l'expression de ZEB1 in situ et d'établir une corrélation directe entre la mutation MYD88L265P et la surexpression de ZEB1. Cette approche permettra de déterminer si l'expression élevée de ZEB1 est associée aux formes les plus agressives de LBCL, notamment celles présentant un tropisme marqué pour les niches extra-ganglionnaires comme le SNC. L'objectif est d'identifier un lien robuste entre profil mutationnel, l'expression de ZEB1, et la dissémination extra-ganglionnaire.
Sur le plan mécanistique, le projet s'attachera à caractériser précisément les voies reliant l'activation de MYD88 à la régulation de ZEB1, et à déterminer l'impact de ce facteur de transcription sur le tropisme des cellules lymphomateuses pour des niches extra-ganglionnaires, notamment le SNC.
Enfin, il visera à identifier des signatures moléculaires associées à ces propriétés invasives et à explorer leur potentiel en tant que biomarqueurs pronostiques ou cibles thérapeutiques, afin d'améliorer la stratification et la prise en charge des patients atteints de formes agressives de LBCL.

Afin d'explorer cette hypothèse, le projet de recherche se structure en trois axes principaux pour lesquels les approches expérimentales sont détaillées :

Axe 1 : Valider le lien fonctionnel entre MYD88L265P et la surexpression de ZEB1 et en déterminer le mécanisme moléculaire.
Objectif 1 : Caractériser l'expression des marqueurs ZEB1 sur une cohorte de 40 échantillons de patients LBCL
Afin de confirmer la surexpression de ZEB1 dans les ABC LBCL MYD88L265P, nous réaliserons des marquages en multi-immunofluorescence (CD19, ZEB1 et DAPI, plateforme Vectra Polaris Akoya) sur une cohorte rétrospective de 40 biopsies FFPE reflétant l'hétérogénéité anatomique des LBCL. Cette cohorte comprendra 10 cas d'ABC LBCL MYD88L265P d'origine cérébrale, 10 d'origine testiculaire, 10 cas nodaux MYD88L265P et 10 cas nodaux MYD88WT. L'intensité du marquage de ZEB1 dans les cellules CD19 positives (identifiant les cellules LBCL) sera quantifiée et le niveau d'expression de ZEB1 sera corrélé aux caractéristiques cliniques des patients.
Cette étape, indispensable, permettra de renforcer notre hypothèse de travail et d'évaluer le potentiel clinique d'un ciblage futur de la voie.

Objectif 2 : Déterminer le mécanisme moléculaire liant MYD88L265P à la surexpression de ZEB1
Nous analyserons les conséquences de la surexpression de MYD88L265P dans des ABC-LBCL MYD88WT. Suite à la validation de l'expression de la forme oncogénique de MYD88 par western-blot, nous explorerons les changements phénotypiques obtenus (expression de ZEB1 et capacités d'invasion sur Matrigel®).
Nous avons déterminé que la signalisation via MYD88 et la voie NF B conduit à la surexpression de ZEB1. Nous éluciderons le mécanisme impliqué à l'aide d'approches biochimiques et d'imagerie : analyse de la phosphorylation d'IKK/IB par western blot, suivi de la translocation nucléaire de p65 par immunofluorescence, et tests rapporteurs NF B. Ces analyses seront complétées par des qPCR et un profilage des cytokines cibles de NF B, ainsi que par des perturbations fonctionnelles utilisant des inhibiteurs pharmacologiques de cette voie. Nous étudierons également la contribution de MUC1 C, un régulateur bien caractérisé de NF B et un inducteur documenté de ZEB113.
De plus, afin de décrypter le rôle potentiel de ZEB1 dans la dissémination et/ou le « homing » extra-ganglionnaire des LBCL, une analyse transcriptomique sera réalisée à partir des modèles cellulaires dans lesquels l'expression de ZEB1 ou de MYD88L265P aura été modulée expérimentalement. Nous validerons expérimentalement si les gènes identifiés participent à l'acquisition des phénotypes plastiques et invasifs caractéristiques des LBCL MYD88L265P.
Axe 2 : Définir l'impact de ZEB1 sur la motilité et le tropisme extranodal des LBCL mutés.
Objectif 1 : Caractériser le rôle fonctionnel de ZEB1 sur la mobilité des cellules lymphomateuses
Des analyses fonctionnelles seront menées pour évaluer les conséquences de la modulation de ZEB1 dans les LBCL. Cela inclura l'inactivation de ZEB1 par shRNA dans des lignées LBCL MYD88L265P et la surexpression de ZEB1 dans des lignées LBCL MYD88WT. Des premiers modèles cellulaires ont déjà été générés (LBCL MYD88L265P-shRNA ZEB1), les autres modèles sont en cours d'obtention. L'impact sur les propriétés invasives des cellules sera évalué par des tests sur Matrigel®.

Objectif 2 : Explorer le tropisme des LBCL MYD88 mutés pour le système nerveux central
Parmi les localisations entra-ganglionnaires, l'atteinte neurologique primitive ou secondaire des LBCL reste la plus difficile à prendre en charge, avec des options thérapeutiques limitées et bien souvent toxiques. Nous souhaitons donc focaliser le second axe du projet sur ce tropisme en déterminant le rôle de l'axe MYD88/ZEB1 caractérisé dans l'axe 1. Pour cet objectif, deux approches expérimentales complémentaires sont envisagées :
Modèle ex-vivo de co-culture avec des organoïdes cérébraux
Nous utiliserons un modèle de coculture de lignées de LBCL MYD88 sauvages et mutés au sein d'organoïdes cérébraux dérivés d'iPS mimant les principales composantes du microenvironnement cérébral (neurones, astrocytes). Les lignées LBCL MYD88L265P ou MYD88WT ont été transduites pour exprimer la GFP afin de permettre leur suivi. La migration, l'invasion et l'adhésion des cellules tumorales seront évaluées par imagerie en temps réel et par des tests quantitatifs de migration. Les LBCL GFP+ seront imagés au cours du temps par microscopie biphotonique. L'analyse d'images permettra de quantifier les trajectoires, déplacements, vitesses et distributions spatiales des cellules par rapport aux structures de l'organoïde.
Ces expériences permettront de déterminer si les LBCL MYD88L265P présentent une attraction préférentielle pour certaines composantes cellulaires du microenvironnement cérébral. Pour valider le rôle de ZEB1 dans ce processus, les conséquences de son inactivation par shRNA dans les LBCL MYD88L265P seront évaluées dans les mêmes conditions de co-culture.
Modèle in-vivo
En parallèle et afin de mitiger le risque lié à ces systèmes de co-culture artificiels, nous travaillerons sur un modèle murin de souris immunodéficiente. Dans un premier temps, nous analyserons l'impact de la mutation MYD88L265P sur le développement intracérébral des LBCL, en réalisant des xénogreffes. Quatre lignées cellulaires humaines seront testées, deux portant le MYD88 sauvage et deux portant la mutation L265P. Chaque lignée sera implantée en intracérébral chez 10 souris, afin d'assurer une puissance statistique suffisante pour comparer les phénotypes associés. Le suivi de la progression du greffon reposera sur l'expression combinée de la luciférase et de la GFP, permettant un monitoring dynamique de la croissance tumorale. En complément, une analyse histologique approfondie sera réalisée sur les tumeurs, incluant des marqueurs représentatifs du microenvironnement et de l'état cellulaire : GFAP (astrocytes réactifs), NeuN (neurones), Ki67 (prolifération), CD31 (vascularisation) et HIF 1 (réponse à l'hypoxie). Cet ensemble d'approches permettra de déterminer si la mutation MYD88L265P confère aux LBCL des capacités d'adaptation au microenvironnement cérébral.
Suite à ces expériences, nous réaliserons des xénogreffes à partir des modèles LBCL-MYD88L265P dans lesquels l'expression de ZEB1 aura été inactivée afin d'étudier l'impact de l'expression de ZEB1 sur le développement intracérébral des LBCL MYD88L265P.
Axe 3 : Disséquer l'interface autonome/microenvironnement (MYD88L2656P nodal vs SNC) afin de cartographier les signatures de motilité et d'identifier des biomarqueurs de pronostic et de réponse thérapeutique.
Dans cet axe, nous chercherons à disséquer l'interface entre les programmes autonomes des cellules tumorales et leur microenvironnement, en comparant spécifiquement les DLBCL du SNC et les formes nodales porteuses ou non de la mutation MYD88L265P. Pour cela, nous réaliserons une approche de transcriptomique spatiale sur des échantillons FFPE de patients comprenant 4 LBCL du SNC (qui sont systématiquement MYD88L265P), 4 LBCL MYD88L265P nodaux et 4 LBCL MYD88WT nodaux en utilisant la plateforme 10x Visium, incluant l'imagerie H&E et la capture spatiale pour la génération des librairies de séquençage. L'analyse intégrée combinera l'identification des gènes différentiellement exprimés dans l'espace, des analyses GSEA centrées sur des programmes tels que l'EMT ou NF B, ainsi qu'une déconvolution cellulaire pour caractériser la composition du TME dans chaque compartiment. Une attention particulière sera portée aux corrélations spatiales entre marqueurs de motilité et d'invasion (notamment ZEB1) et les fronts infiltratifs ou les zones d'exclusion immune, afin de cartographier les signatures différentielles de plasticité tumorale. Les résultats seront ensuite validés dans des cohortes indépendantes, intégrant données transcriptomiques, statut mutationnel et paramètres cliniques, dans le but d'identifier des biomarqueurs robustes de pronostic et de réponse thérapeutique.

Le projet de thèse requiert un(e) candidat(e) motivé(e), rigoureux(se) et doté(e) d'un solide intérêt pour l'oncologie moléculaire, la biologie des lymphomes et les mécanismes de signalisation cellulaire. Les compétences et aptitudes suivantes sont particulièrement attendues :

1. Formation et connaissances scientifiques
-Master 2 en biologie cellulaire, biologie moléculaire, cancérologie
Connaissances fondamentales en :
-Signalisation cellulaire,
-Transcription et régulation génique,
-Mécanismes de transformation et progression tumorale,
-Immunologie des cellules B
-Connaissances générales en hématologie et en biologie des lymphomes

2. Compétences techniques
Des expériences dans plusieurs des techniques suivantes sont souhaitées :
Biologie moléculaire
-Extraction d'ARN/ADN, RT qPCR, PCR, clonage.
-Western blot, immunoprécipitation, analyses de signalisation.
Biologie cellulaire
-Culture cellulaire (lignées, transfections, infections virales, CRISPR/shRNA si possible).
-Essais fonctionnels : migration, invasion (ex. Matrigel®), viabilité, prolifération.
Imagerie et histologie
-Bases en immunofluorescence, microscopie à fluorescence/confocale.
-Notions d'analyse d'images (ImageJ, HALO, InForm) appréciées.
Outils omiques et analyses bioinformatiques (atout)
-Notions en RNA seq, ATAC seq.
-Familiarité avec R ou Python est un plus (mais non indispensable).
-Notions de statistique médicale

3. Compétences transversales
-Grande rigueur expérimentale, sens de l'organisation, tenue de cahier de laboratoire.
-Capacité à analyser et interpréter des données complexes.
-Esprit critique, autonomie progressive, aptitude à proposer et discuter des hypothèses.
-Capacités de communication orale et écrite (réunions d'équipe, rédaction scientifique).
-Aptitude au travail en équipe dans un environnement pluridisciplinaire (biologistes, cliniciens, bioinformaticiens).

4. Qualités personnelles attendues
-Motivation forte pour s'investir dans un projet de thèse exigeant.
-Curiosité scientifique et goût pour l'apprentissage de nouvelles techniques.
-Persévérance face aux expérimentations complexes et aux analyses longues.