Thèse Entraîner l'Immunité Innée de la Glande Mammaire chez le Bovin pour Diminuer sa Sensibilité aux Infections Bactériennes H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut National Polytechnique de Toulouse
École doctorale : SEVAB - Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries
Laboratoire de recherche : IHAP - Laboratoire Interactions Hôtes-Agents Pathogènes
Direction de la thèse : Gilles FOUCRAS ORCID 0000000203630337
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-20T23:59:59

En Europe, environ 20 millions de vaches laitières produisent 154 millions de tonnes de lait, faisant des produits laitiers la principale denrée agricole de l'UE. Cependant, l'élevage laitier fait face à des défis majeurs, notamment la mammite, une infection bactérienne courante qui affecte la santé des vaches et la production de lait. La mammite est la principale cause d'utilisation d'antibiotiques en élevage laitier, mais les efforts pour réduire cette utilisation sont insuffisants en raison de la prévalence élevée de la maladie. Pour lutter contre la mammite, des alternatives comme la vaccination sont explorées, mais des difficultés techniques subsistent. Des approches innovantes basées sur l'immunité innée sont nécessaires. La recherche se concentre sur la compréhension de la physiologie immunitaire mammaire et le développement de nouvelles thérapies. Les organoïdes, des structures 3D imitant les organes, offrent une méthode prometteuse pour tester des molécules immunostimulantes et comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'infection. Le projet de thèse développé par l'étudiant.e aura pour objectif de mettre au point des stratégies innovantes d'entraînement de l'immunité mammaire pour accroître la résistance des animaux aux infections. Les objectifs du projet de thèse s'articuleront autour de trois axes principaux : (i) Établir pour la première fois un modèle complexe de co-culture en 3D d'organoïdes épithéliaux et de cellules immunitaires pour reproduire l'environnement et la physiologie immunitaire de la glande mammaire, (ii) Caractériser les réponses de ces cultures complexes en condition infectieuse par des agents pathogènes majeurs responsables de mammite et (iii) Cribler des composés bioactifs capables d'entraîner l'immunité et ainsi diminuer la sensibilité à l'infection. Grâce aux résultats obtenus par le doctorant(e), une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse anti-infectieuse de la glande mammaire permettra d'identifier de nouvelles cibles pour la prévention de ces infections et d'améliorer la santé des animaux tout en diminuant l'utilisation de molécules antibiotiques.

En Europe, environ 20 millions de vaches laitières produisent 154 millions de tonnes de lait. Les produits laitiers constituent la principale denrée agricole de l'UE, représentant 15% de la production. L'élevage fait face à d'importants défis liés au contrôle des maladies infectieuses endémiques, souvent d'origine bactérienne. La mammite, due à la colonisation de la glande mammaire par des bactéries communes, est très répandue et affecte fortement la santé, le bien-être et la production laitière, en faisant l'une des maladies animales les plus coûteuses1,2. Elle est la première cause d'utilisation d'antibiotiques en élevage laitier, représentant deux tiers des traitements. Malgré des efforts importants, la réduction de l'antibiothérapie reste limitée en raison de la forte prévalence de la maladie. Il est donc essentiel de développer des alternatives efficaces pour prévenir ou traiter ces infections. La vaccination est prometteuse mais se heurte à des obstacles techniques liés à la diversité des agents pathogènes, entraînant l'absence de vaccins sûrs et efficaces pour la plupart d'entre eux (Escherichia coli, Staphylococcus, Klebsiella...). Des approches innovantes basées sur l'entraînement de l'immunité innée, introduites par Mihai G. Netea, désignent une forme de mémoire fonctionnelle de l'immunité innée à travers des reprogrammations épigénétiques et des changements du métabolisme cellulaire3. Plusieurs études soulignent l'intérêt de cette stratégie en santé des ruminants, ouvrant la voie à des stratégies innovantes de stimulation non spécifique 4,5.
L'amélioration des connaissances sur la physiologie immunitaire mammaire et la description des mécanismes moléculaires et cellulaires de l'infection sont essentielles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Deux populations cellulaires jouent un rôle majeur contre les pathogènes responsables de la mammite : les cellules épithéliales, formant une barrière physique, et les cellules immunitaires, principalement les macrophages. Grâce au séquençage scRNAseq, l'équipe a identifié des macrophages canalaires situés à la surface des acini et des canaux lactifères6, agissant comme sentinelles initiant la réponse anti-infectieuse7. L'industrie et les laboratoires se concentrent sur l'identification de molécules antimicrobiennes, anti-inflammatoires ou immunostimulantes, mais leur criblage ne peut être réalisé directement chez l'animal pour des raisons éthiques et financières. Les organoïdes, structures 3D mimant partiellement les organes, offrent une solution pertinente pour tester ces molécules et reproduire la physiologie mammaire8. Le développement de modèles 3D complexes combinant cellules épithéliales et immunitaires constitue une approche innovante pour étudier les mécanismes physiologiques ou infectieux, tout en respectant les principes des 3R, essentiels pour la recherche sur les grands animaux

Le projet de thèse développé par l'étudiant.e permettra de mettre au point des stratégies innovantes de préservation de la santé chez le bovin en diminuant sa sensibilité aux mammites.
Les objectifs du projet de thèse s'articuleront autour de 3 axes :
(i) Etablir pour la première fois un modèle complexe de co-culture en 3D d'organoïdes mammaires épithéliaux et de cellules immunitaires pour reproduire les interactions cellulaires dans l'environnement et la physiologie de la glande mammaire.
(ii) Caractériser les réponses cellulaires dans des conditions infectieuses pour évaluer l'infection par des agents pathogènes majeurs responsables de mammite (par exemple E. coli ou K. pneumoniae)
(iii) Cribler des composés bioactifs capables d'entraîner le système immunitaire inné et ainsi diminuer la sensibilité de ces animaux à l'infection.
Ainsi la compréhension des mécanismes sous-jacents impliquées dans les réponses anti-infectieuses de la glande mammaire identifiera de nouvelles cibles thérapeutiques et en fin de compte, permettra d'améliorer la santé des animaux tout en diminuant l'utilisation de molécules antibiotiques.

Le projet de thèse s'organisera autour de 3 axes :
Axe 1 : Mise en place d'un modèle de co-culture d'organoïdes épithéliaux et de macrophages en 3D reproduisant le répertoire immunitaire inné de la glande mammaire.
Tâche 1 : Développement d'un modèle du système immunitaire inné mammaire.
Les organoïdes mammaires seront cultivés selon les protocoles établis dans l'équipe à partir de cellules souches isolées du parenchyme mammaire d'animaux de différents âges et stades physiologiques (en lactation, involution ou prépubères)9. Les macrophages canalaires seront isolés soit directement à partir de glande mammaire bovine prélevée sur les mêmes animaux, soit à partir du sang périphérique (PBMC). Les co-cultures directes pourront être construites de différentes manières, notamment en dôme immergé avec ajout de cellules immunitaires. Des travaux antérieurs ont montré que la densité des hydrogels limite l'infiltration immunitaire 10. Dans un premier temps, organoïdes et cellules immunitaires seront cultivés séparément avant leur mise en contact. Une fois développés, les organoïdes seront remis en suspension pour éliminer le Matrigel. Les cultures en suspension d'organoïdes et de cellules immunitaires seront ensuite cultivées avec une quantité réduite de Matrigel (à déterminer), permettant l'infiltration des macrophages canalaires sans altérer la structure 3D ni la morphologie des organoïdes.

Tâche 2 : Caractérisation fine du modèle en coculture et comparaison avec le tissu natif. Les cellules obtenues dans le modèle de coculture 3D seront caractérisées par imagerie à l'aide des techniques disponibles et maîtrisées dans l'équipe d'accueil : la cytométrie en flux et la microscopie confocale. Cependant pour aller plus loin dans la caractérisation moléculaire et transcriptomique de ces modèles cellulaires 3D complexes et de leur pertinence avec le tissu mammaire natif, du séquençage haut débit de l'ARN des cellules isolées (scRNAseq) sera réalisé sur les plateaux technologiques toulousains (Genotoul) afin de déterminer les principales empreintes phénotypiques et moléculaires des différentes populations cellulaires. Environ 10 000 cellules seront utilisées pour le séquençage et environ 2 milliards de couples de reads seront générés grâce à la technologie de séquençage 10X Genomics déjà utilisée en santé animale 11. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus à partir de cellules isolées directement de la glande mammaire afin de valider la pertinence du modèle et ses utilisations potentielles dans le futur.

Axe 2 : Caractériser les réponses cellulaires en conditions infectieuses avec les pathogènes majeurs pour évaluer les évènements précoces de la réponse
Après l'étape de caractérisation et de validation du modèle (Axe 1), les cultures seront infectées avec des bactéries pathogènes Gram négatives E. coli ou K. pneumoniae 12,13 avant que ce modèle soit utilisé pour cribler l'effet de molécules entraînant l'immunité innée sur la sévérité de l'infection bactérienne. Les cellules épithéliales ont des domaines apicaux et basolatéraux distincts, qui servent de frontière entre différents microenvironnements. L'inaccessibilité du côté apical des cellules épithéliales dans les cultures d'organoïdes 3D classiques est problématique pour l'étude des biomolécules ou des micro-organismes qui interagissent avec le côté apical des cellules organisées en tissu. Une alternative sera de cultiver les organoïdes à plat, en 2D sur insert. Pour ce faire, les organoïdes mammaires 3D sont dissociés en cellules individuelles et ensemencés sur des inserts. Les membranes poreuses des inserts seront recouvertes d'une fine couche de Matrigel pour fournir les signaux nécessaires à la survie des cellules souches tout en empêchant la croissance des structures 3D. Ainsi, l'analyse différentielle de la signalisation et de la réponse cellulaire évaluera la capacité du pathogène à infecter les cellules et à se multiplier en présence ou pas d'entraînement, à l'aide d'une analyse microbiologique (comptage des UFC) et d'approches d'imagerie et de cytométrie en flux avec l'utilisation de bactéries fluorescentes 14,15.

Axe 3 : Cribler des composés bioactifs capables d'entraîner le système immunitaire inné et diminuer la sensibilité des cellules à l'infection bactérienne.
Le système immunitaire inné, représenté ici par les cellules épithéliales et, majoritairement, les macrophages, possède une mémoire des expositions infectieuses antérieures. Le premier épisode infectieux, se produit principalement en post-partum lorsque la lactation débute chez la vache laitière ; l'entraînement de l'immunité pourrait protéger le parenchyme mammaire contre l'apparition ou la récurrence de l'infection et la mammite subséquente. Le criblage de molécules candidates présélectionnées pour l'entraînement immunitaire (ex. : -glucanes, déjà caractérisées dans l'équipe d'accueil16 sera effectué dans un contexte infectieux (Axe 2) afin de mesurer leur activité potentielle. Des études antérieures ont montré que l'administration intra-mammaire de bêta-glucanes était bien tolérée et qu'elle améliorait l'issue de l'infection mammaire 17. Le modèle développé analysera les réponses des différentes populations cellulaires dans des conditions d'entraînement. Pour les axes 2 et 3, des tests à haut débit pour les cytokines bovines (tests à base de billes développés par l'équipe 18) et l'expression des gènes seront évalués à l'aide du séquençage de l'ARN d'une seule cellule pour comprendre les mécanismes propres à chaque population cellulaire 6. Cela permettra de distinguer les effets spécifiques des cellules épithéliales des organoïdes de la glande mammaire de ceux des cellules immunitaires.

Un.e candidat.e titulaire d'un M2 en biologie cellulaire, biotechnologie, microbiologie ou immunologie et maladies infectieuses est recherché. Une appétence pour les sciences vétérinaires et la santé animale sera appréciée. Des compétences techniques en culture cellulaire, techniques de microbiologie et imagerie (cytométrie et microscopie) sont souhaitées. Des notions en analyses statistiques et bioinformatique (Graphpad Prism, R studio ou Python) ainsi qu'en bureautiques seront également requises. Des aptitudes avances à la compréhension et l'expression écrite en Français et en Anglais sont attendues.