Thèse Exposition Chronique à des Additifs Alimentaires Riches en Aluminium E170 Ins176ii et E554 Impacts sur la Barrière Intestinale et les Fonctions Immunitaires et Cognitives chez la Souris. H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Toulouse École doctorale : SEVAB - Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries Laboratoire de recherche : TOXALIM - Laboratoire de Toxicologie Alimentaire Direction de la thèse : Eric HOUDEAU ORCID 0000000319719827 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-01T23:59:59 L'aluminium (Al) est neurotoxique et immunotoxique. Il traverse la barrière placentaire et entraîne des troubles cognitifs et comportementaux. L'alimentation est la principale voie d'exposition à l'Al pour l'être humain, en raison de sa présence naturelle dans l'environnement, mais aussi des activités anthropiques, quel que soit le secteur industriel jusqu'à la transformation des denrées alimentaires (e.g., additifs, emballages). Pour l'EFSA, certains additifs contenant de l'Al, utilisés comme antiagglomérants, colorants, stabilisants ou régulateurs d'acidité, sont considérés comme source majeure d'apport en Al chez l'homme. L'exposition alimentaire totale à l'Al varie ainsi de 0,2 à 1,5 mg/kg de poids corporel par semaine, jusqu'à 2,3 mg/kg pc par semaine chez les jeunes enfants, ce qui dépasse la dose hebdomadaire tolérable (DHT) de l'Al fixée à 1 mg/kg de poids corporel par semaine dans l'UE.
Parmi ces additifs alimentaires, le carbonate de calcium (CaCO3 ou E170) est utilisé pour diverses fonctions technologiques en plus d'être un donneur de calcium (Ca2+) à des fins nutritionnelles, via les préparations pour nourrissons, les céréales et les biscuits, ou comme complément alimentaire chez l'adulte carencé. Si en 2023 l'EFSA a conclu en l'absence de risque en tant que source de Ca2+ pour les nourrissons, la présence d'Al dans sa formulation reste préoccupante. Il contient 4 à 5 % d''Al et comme le CaCO3 est soluble dans les acides gastriques, son seul usage comme source de Ca2+ peut atteindre 100% de la DHT humaine pour l'Al. Ce chiffre est par ailleurs probablement sous-estimé, le E170 comme colorant étant devenu la principale alternative au dioxyde de titane (E171) dans de nombreux produits alimentaires suite à l'interdiction du E171 dans l'UE en 2022. Ces mêmes questions se posent lorsque le E170 est ingéré avec d'autres additifs à base d'Al, tels les silicates de sodium, de potassium ou de calcium et silicates d'aluminium (série E554-559) utilisés pour leurs propriétés anti-agglomérantes et de colorants. Par exemple le E555 (20 % d'Al) sous son appellation INS176ii est utilisé comme support au E172 (oxyde de fer) pour obtenir des effets nacrés dans des confiseries, boissons, pâtisseries et crèmes glacées, responsable d'un dépassement jusqu'à 300 fois de la DHT de l'Al chez les individus exposés, principalement l'enfant. Selon l'EFSA, l'exposition humaine à l'Al liée à l'utilisation d'un autre anti-agglomérant, le E554 (silicate alumino-sodique), est estimé entre 1,58 et 2,13 mg/kg de poids corporel/semaine, dépassant aussi la DHT.
L'objectif du projet de thèse est d'évaluer les effets du E170, du E554 et de l'INS176ii, seuls ou en mélange, sur l'intégrité de la barrière intestinale, les réponses immunitaires locales et systémiques et les fonctions cérébrales de souris exposées de la période périnatale à l'âge adulte. En s'appuyant sur un réseau complémentaire en physico-chimie et pour la détection des éléments par microscopie électronique, une caractérisation complète de ces additifs alimentaires sera réalisée, comptant la présence de nanoparticules. Nous étudierons le devenir de l'Al issu de ces additifs du commerce, ainsi que leurs effets santé chez la descendance en comparaison d'un donneur référent d'Al (sels d'aluminium AlCl3). Ce projet permettra d'améliorer les connaissances sur les sources alimentaires d'Al depuis les aliments transformés et de déterminer si ces additifs contribuent à son accumulation dans l'organisme, potentiellement accompagnée de troubles intestinaux et de dysfonctionnements immunitaires et/ou cérébraux. Ce projet permettra d'obtenir des données scientifiques nouvelles utiles aux agences de sécurité alimentaire et aux politiques publiques pour formuler des recommandations sur les limites de pureté des additifs alimentaires autorisés en termes de teneur en Al pour une utilisation sans danger par la population générale, y compris les enfants et les nourrissons nourris au lait maternisé. L'alimentation est la principale voie d'exposition à l'aluminium (Al) chez l'être humain, en raison de la présence naturelle d'Al dans l'environnement (pratiquement toutes les denrées en contiennent naturellement, en particulier les céréales), mais aussi des activités anthropiques (extraction minière, production de métaux, colorants, alliages) pour divers usages1,2. Cela inclut des produits de la vie courante (appareils ménagers, produits pharmaceutiques, cosmétiques) et l'industrie alimentaire (stockage, additifs, matériaux d'emballage, ustensiles de cuisson) depuis la production des aliments (pesticides). S'agissant des additifs alimentaires, l'utilisation de 11 substances contenant de l'Al et utilisés pour diverses finalités technologiques (agents antiagglomérants, colorants, agents de stabilisation, régulateurs d'acidité) a été considérée par l'EFSA comme un contributeur majeur à la contamination en Al de l'Homme1,3. L'exposition alimentaire totale estimée à l'Al varie de 0,2 à 1,5 mg/kg de poids corporel (pc) par semaine, et peut atteindre 2,3 mg/kg pc/semaine chez les consommateurs fortement exposés (principalement les toutpetits), ce qui dépasse la dose hebdomadaire tolérable (DHT) de 1 mg/kg pc/semaine fixée dans l'UE3.
Après absorption, l'Al se distribue dans l'ensemble des tissus et s'accumule dans certains d'entre eux, en particulier l'os, mais il peut également pénétrer le cerveau et atteindre le placenta et le foetus chez l'animal comme chez l'homme. En effet, les travaux de l'équipe ENTeRisk ont récemment montré que des particules d'Al étaient retrouvées dans le placenta humain et dans le méconium (i.e., les premières selles des nouveaunés), démontrant une exposition foetale4. Des particules d'Al sont aussi fréquemment observées dans les plaques de Peyer de biopsies intestinales humaines, témoignant de l'origine alimentaire5-7. Une fois absorbé, le principal transporteur de l'ion Al+ dans le plasma est la transferrine (protéine de fixation du fer), et l'Al peut persister très longtemps dans divers organes et tissus avant d'être éliminé dans les urines. La toxicité de l'Al affecte principalement le système nerveux central (troubles psychomoteurs, encéphalopathies, jusqu'au risque de maladies neurodégénératives et de démence) avec des répercussions neurodéveloppementales, y compris chez l'humain8,9. D'autres études ont également montré que l'Al est immunotoxique (sous forme ionique, de composés chimiques ou de particules fines), capable de favoriser la libération de cytokines (effet adjuvant), de déclencher une inflammation et de provoquer divers dysfonctionnements des cellules immunitaires10,11. Comme indiqué plus haut, les aliments transformés présentent les teneurs les plus élevées en Al via les additifs alimentaires et constituent la principale source d'apport alimentaire en Al chez l'enfant et l'adolescent12. Toutefois, la plupart des études démontrant le potentiel neurotoxique et immunotoxique de l'Al utilisent du chlorure d'aluminium (AlCl3) ou des nanoparticules d'Al, qui ne reflètent pas les formes physicochimiques des additifs alimentaires riches en Al, susceptibles de présenter une biodisponibilité et une distribution différentes8-11,13,14. De plus, l'EFSA a souligné dans son rapport l'absence de données toxicologiques spécifiques sur l'Al provenant des additifs alimentaires, couvrant l'exposition au cours du développement (i.e., dès la vie in utero depuis l'alimentation maternelle) et les conséquences potentielles sur la santé à l'âge adulte1,3,15. Cela concerne les fonctions cérébrales, mais aussi le système immunitaire systémique et intestinal, quand l'intestin contribuent de manière déterminante au rôle de barrière biologique visàvis de l'environnement et, au final, à la santé de l'individu. Il est donc important de caractériser la contribution spécifique de ces additifs issus des aliments transformés à la contamination globale par l'Al via l'alimentation, et d'en évaluer leurs effets au niveau cérébral, immunitaire et intestinal après exposition chronique débutant dès le développement.
Parmi ces additifs, le carbonate de calcium (CaCO3) est un additif antiagglomérant (E170 dans l'UE), également utilisé comme pigment blanc parmi d'autres fonctions technologiques (régulateur d'acidité, stabilisant, agent de coloration de surface, etc.). Le E170 est aussi une source de calcium (Ca2+) à des fins nutritionnelles, par exemple pour l'enrichissement des laits infantiles, des céréales et biscuits, et comme complément alimentaire chez l'adulte carencé. En 2023, l'EFSA a indiqué que, s'il n'y avait pas de préoccupation de sécurité en tant que source de Ca2+ pour les nourrissons de moins de 16 semaines, la présence inévitable d'Al dans sa formule est en revanche préoccupante et doit être prise en compte dans le calcul de l'apport total en Al15. En effet, le CaCO3 de qualité alimentaire est extrait de la craie (un matériau argileux) et contient 4-5% d'Al. Par conséquent, la teneur en Al du E170 commercialisé varie de 11 à 720 mg d'Al/kg d'additif15. Comme le CaCO3 est soluble à 95-100% dans les acides gastriques (i.e., Al potentiellement biodisponible après absorption dans l'intestin), le E170 constitue un contributeur important de l'apport alimentaire en Al chez l'Homme, pouvant atteindre 50-100% de la DHT pour l'Al lorsqu'il est utilisé comme seule source de Ca2+15. Par ailleurs, cette estimation est probablement sousévaluée car le E170 est aussi devenu la principale alternative au dioxyde de titane (TiO2) de qualité alimentaire (E171) comme agent blanchissant depuis l'interdiction du E171 dans l'UE en 2022. En conséquence, l'usage du E170 est en très forte augmentation dans les produits alimentaires du quotidien, mais aussi dans les dentifrices et les médicaments en remplacement du TiO2 dans ces autres produits du quotidien.
Des préoccupations de sécurité se posent également lorsque le E170 est ingéré conjointement avec d'autres additifs alimentaires contenant de l'Al, principalement de la série E554-E559 (silicates de sodium, potassium ou calcium et silicates d'aluminium) utilisés quantum satis pour leurs propriétés antiagglomérantes1,3. En particulier, le E555 (contenant 20% d'Al16) est utilisé dans diverses applications de confiserie, boissons, pâtisseries, glaces comme support au E172 (oxydes de fer) pour produire des effets nacrés (additif composite désigné INS176ii dans le Codex Alimentarius)3. Dans ce cas, l'apport alimentaire global en Al dépasse largement la DHT, pouvant être multiplié jusqu'à 300 chez les enfants exposés à l'INS176ii3. Par ailleurs, le E554 (silicate alumino-sodique) utilisé dans différentes poudres alimentaires (sel, sucre, soupes, épices,...) aussi pour ses propriétés anti-agglomérantes peut contenir jusqu'à 7,8% d'Al. L'exposition humaine maximale à l'Al liée à l'utilisation du E554 seul est estimé par l'EFSA entre 1,58 et 2,13 mg/kg de poids corporel/semaine, ce qui dépasse également la DHT3.
Actuellement, les données scientifiques ne permettent pas de conclure sur l'absorption d'Al ni sur la toxicité liée à l'Al de ces additifs alimentaires, qui doivent être évaluées seuls et en mélange dans des études animales utilisant, pour chacun d'eux, des niveaux d'exposition pertinents pour l'être humain. Le présent projet de thèse s'inscrit dans cette démarche nécessaire à l'évaluation du risque pour l'homme et propose d'étudier le devenir et les effets des trois additifs alimentaires (E170, INS176ii, E554) les plus représentatifs en tant que donneurs d'Al pour l'organisme. L'alimentation est la principale voie d'exposition de l'homme à l'aluminium (Al), une dose hebdomadaire tolérable (DHT) de 1mg/kg de poids corporel/semaine ayant été fixée pour éviter tout risque de surexposition compte tenu d'effets neurotoxiques et immunotoxiques liés à ce métal. Or l'Autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA) a alerté dès 2008 que certains additifs alimentaires contenant de l'Al (comme constituant élémentaire ou impuretés) étaient une source supplémentaire d'exposition à ce métal, leur consommation régulière étant susceptible de dépasser la DHT, en particulier chez l'enfant et l'adolescent. Face au risque de toxicité, le projet de thèse a pour objectif d'évaluer chez la souris les effets de trois additifs alimentaires donneurs d'Al les plus représentés dans les aliments transformés (E170, INS176ii et E554), administrés seuls ou en mélange et à des niveaux pertinents pour l'Homme. En s'appuyant sur une étude longitudinale couvrant la période allant de la vie in utero à l'âge adulte chez la souris, basée sur les lignes directrices de l'OCDE pour mimer l'exposition humaine via l'alimentation en population générale, ce projet fournira des données nouvelles sur l'absorption et le devenir systémique de l'Al issu de ces additifs, consommés isolément ou en combinaison via l'alimentation. Les effets seront évalués sur la fonction de barrière intestinale (intégrité épithéliale, perméabilité de l'intestin, composition du microbiote), la réponse immunitaire (locale et systémique) et les fonctions cérébrales (cognitives et mnésiques), en comparaison au chlorure d'aluminium (AlCl3), un composé référent soluble utilisé dans les études de neurotoxicité et d'immunotoxicité. Ce projet déterminera ainsi dans quelle mesure l'Al issu de ces additifs est biodisponible pour l'organisme, et est susceptible ou non de favoriser la survenue de troubles intestinaux, immunitaires et/ou neurodéveloppementaux. Des lots commerciaux de E170, INS176ii, E554 et AlCl3 seront caractérisés par le Laboratoire National de métrologie et d'Essai (LNE) et le Groupe Physique des Matériaux (GPM), en particulier pour leur teneur totale en Al et leurs caractéristiques physicochimiques (forme particulaire, taille, distribution granulométrique). Chaque additif (E170, INS176ii et E554), le chlorure d'aluminium (AlCl3), ainsi qu'un cocktail combinant les trois additifs (E170+INS176ii+E554), seront incorporés dans les croquettes. Les doses d'additifs seront choisies pour encadrer l'exposition humaine via l'alimentation et déterminées sur la base des scenarii d'exposition aux additifs définis par l'EFSA. Les souris femelles (« mères ») seront exposées au régime contrôle ou enrichi en additifs 40 jours avant la mise au mâle, puis pendant toute la durée de la gestation et de la lactation. La biodistribution de l'Al dans les tissus foetaux sera étudiée dans un sousgroupe de femelles gestantes un jour avant la mise bas. Au jour postnatal (PND) 21, les souriceaux (« descendants ») seront randomisés et répartis en groupes de 12 mâles et 12 femelles, puis nourris avec le même régime que leur mère afin de poursuivre l'exposition chez la descendance. Ainsi, les souris F1 seront exposées aux additifs alimentaires in utero, durant la lactation et jusqu'à l'âge adulte. La prise alimentaire ainsi que le poids des animaux seront suivies chaque semaine. Les descendants seront sacrifiés aux PND 21 et 90.En première intention (Année 1 de thèse), nous évaluerons si l'Al issu des additifs donnés aux souris gestantes puis allaitantes peut se redistribuer au compartiment foetal et/ou dans le lait maternel et sous quelle forme (ioniques et/ou particulaire). Les approches feront appel au dosage ICP-MS de l'élément Al (réalisé au LNE, Paris) dans l'unité foeto-placentaire (UFP prélevées à terme de gestation et dosages sur les foetus entiers séparés du placenta) et dans le lait maternel collecté à J7 postnatal17. Des mesures aux doses d'intérêt ainsi que sur les animaux contrôles seront réalisées pour vérifier une accumulation dose-dépendante au compartiment foetal. Des coupes histologiques de placenta, de foie, de rate et de cerveau foetal seront analysées en microscopie électronique à transmission (MET) couplée à la spectroscopie aux rayons X (MET-EDX) par le GPM (Université de Rouen) pour confirmer le passage transplacentaire et renseigner sur la distribution cellulaire et la taille des particules d'Al jusqu'au cerveau4,17,18. Enfin le nombre et le poids des nouveau-nés à la naissance renseigneront également sur un possible retard de croissance intra-utérin (RCIU) en réponse à l'exposition périnatale aux additifs.

Pendant l'Année 1 puis 2, nous étudierons les conséquences d'une exposition chronique aux additifs sur l'intégrité de la barrière intestinale et la réponse immune en comparaison à l'AlCl3. Le côlon, l'iléon, les noeuds lymphatiques mésentériques (MLN) et la rate seront prélevés chez les descendants à PND21 et 90 afin de caractériser le profil d'inflammation intestinale et systémique, par l'analyse de l'expression génique et/ou protéique de cytokines proinflammatoires (IL1, TNF, IFN, IL6, IL17, IL22) et antiinflammatoires (TGF, IL10) par RTqPCR et ELISA17-19. La perméabilité intestinale aux macromolécules sera évaluée in vivo par administration orale de FITCdextran suivie de la mesure de la fluorescence plasmatique17. La cytométrie en flux nous permettra d'analyser le phénotype et l'état de maturation des différents acteurs immunitaires localisés au sein de la lamina propria du côlon et du petit intestin, ainsi que dans les MLN et la rate (macrophages, cellules dendritiques et lymphocytes)20. Des fèces seront collectées chez les descendants à PND21 et 90 afin d'évaluer la composition du microbiote intestinal par séquençage 16S18,21,22. Les niveaux fécaux de flagelline, de LPS et de ligands AhR seront évalués à l'aide de systèmes rapporteurs afin de déterminer le potentiel pro-inflammatoire du microbiote intestinal21,22. Pour évaluer si l'exposition à ces additifs favorise le développement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), certains animaux seront exposés à du DSS dans l'eau de boisson pour induire une colite expérimentale. La sévérité de la colite sera déterminée en évaluant le poids corporel, l'inflammation intestinale et les scores histologiques sur des coupes de côlon21. L'utilisation d'organoïdes intestinaux et cellules immunitaires primaires permettra de déterminer les mécanismes d'actions des additifs seuls ou en mélange via l'évaluation ex vivo des effets directs de ces produits sur la barrière épithéliale et le système immunitaire22,23. L'ensemble de ces approches sont réalisées en routine au laboratoire d'accueil à Toxalim.

L'Année 3 sera mise à profit pour évaluer les conséquences d'une exposition chronique aux additifs seuls ou en mélange sur les fonctions cérébrales (comportements sensorimoteurs, émotionnels et cognitifs) et si une dysbiose dans l'intestin participe aux effets délétères des additifs. Ce travail sera réalisé en collaboration étroite avec le laboratoire Neuro-Dol INSERM de Clermont-Ferrand qui dispose de toutes les compétences pour la réalisation de tests comportementaux chez le souriceau. Dans un premier temps, nous identifierons si l'exposition périnatale aux additifs peut s'accompagner d'altérations dans le développement des fonctions cérébrales des descendants F1. Chez les jeunes individus (PND21) et les descendants adultes (PND90) des deux sexes, le « bienêtre » global de l'hôte sera évalué à partir d'une caractérisation des altérations cognitives et émotionnelles à l'aide de plusieurs tests comportementaux de référence, incluant des tests d'anxiété chez la souris (labyrinthe en croix surélevé, hole board, open field, boîte clair/obscur), de type dépressif (test de suspension par la queue, test de nage forcée) et cognitifs (labyrinthe en Y, tests de reconnaissance d'objet nouveau et de localisation nouvelle)24,25. En parallèle, les cerveaux des animaux seront prélevés et immédiatement congelés dans l'azote liquide. Des biopsies seront ensuite réalisées dans différentes régions cérébrales impliquées dans les comportements cognitivoémotionnels, telles que l'hippocampe et le cortex préfrontal (PFC)26. Les caractéristiques cérébrales, notamment l'inflammation et l'activation neuronale, seront ainsi évaluées et corrélées au profil complet de « malêtre » comportemental. L'expression et la sécrétion de cytokines seront mesurées par RTqPCR ou à l'aide de tests immunologiques multiplex25,27. Etant donnée que les signatures comportementales pathologiques peuvent refléter des altérations de la dynamique des réseaux synaptiques, la présence de telles altérations sera explorée en réalisant des immunomarquages visant à évaluer l'activation neuronale via la détection de cFos (clone 9F6), ainsi que la présence de microglie réactive (marquage Iba1, WAKO) et d'astrocytes (marquage GFAP, clone AB5541, Millipore), afin de relier ces paramètres fonctionnels aux marqueurs de neuroinflammation.
Enfin, pour déterminer le rôle du microbiote intestinal dans les effets délétères des additifs, des fèces fraiches des animaux F1 exposés ou non aux cocktails inorganiques seront récoltées et immédiatement transférées en chambre anaérobie (site Toxalim) afin d'être diluées dans du milieu de culture approprié21,28. Ces suspensions fécales seront inoculées par gavage gastrique à des souris germ-free (de même sexe). Trois semaines après inoculation, la composition bactérienne du microbiote sera déterminée afin de confirmer que le profil bactérien chez les souris receveuses correspond à celui des donneuses21,28. Chez les souris receveuses, les fonctions intestinales et immunitaires seront évaluées comme décrit ci-dessus pour déterminer si le microbiote modifié en réponse à l'exposition préalable aux additifs riche en Al contribue à des altérations21,28. A l'Unité Neuro-Dol, de nouvelles séries de tests comportementaux et d'analyses seront mises en oeuvre sur les souris receveuses pour conclure au potentiel de causalité entre la dysbiose et les altérations comportementales et cérébrales.

Le candidat devra avoir un Master en biologie-santé.
Il/elle devra posséder des connaissances en physiologie digestive et/ou en immunologie. Une première expérience en modèles précliniques (souris) de pathologies intestinales serait un plus. Un intérêt pour les interactions microbiote-hôtes ainsi qu'une sensibilité aux enjeux de sécurité sanitaire des additifs alimentaires seraient des atouts.
Le candidat devra être capable d'analyser et de synthétiser des données. Il/elle devra être rigoureux(se), motivé(e), organisé(e) et en capacité(e) de gérer son temps et de travailler en équipe.