Thèse Thérapie Combinée du Lymphoedème Primaire par Arn et Édition du Génome H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Toulouse École doctorale : BSB - Biologie, Santé, Biotechnologies Laboratoire de recherche : I2MC - Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires Direction de la thèse : Barbara GARMY-SUSINI ORCID 0000000161002294 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-01T23:59:59 Le lymphoedème primaire est une maladie génétique rare caractérisée par un défaut de drainage lymphatiques entraînant une accumulation chronique de liquide interstitiel et de tissu adipeux dans les membres, une inflammation chronique et une fibrose progressive du derme.
Plus de trente gènes impliqués dans le développement du système lymphatique sont associés à des lymphoedèmes primaires. Ils induisent à trois types de lymphoedèmes : congénitaux (dès la naissance), intermédiaires (post-natal ou à l'adolescence), ou tardifs (adultes).
Le lymphoedème peut être également secondaire suite à une lésion du réseau lymphatique après les traitements du cancer (curage ganglionnaire, radio- et chimiothérapie). L'équipe d'accueil a développé un traitement par ARN messager, du lymphoedème secondaire post-cancer : l'Apernavec. Cette thérapie génique innovante combine plusieurs ARNm (Apeline et VEGFC) afin de combiner leurs effets anti-fibrotiques et pro-lymphangiogéniques.

Le projet de thèse visera à mettre en place un traitement du lymphoedème primaire en combinant une thérapie CRISPR/Cas9 pour corriger la mutation, avec une thérapie par ARNm pour réduire les symptômes associés au lymphoedème.
Nous utiliserons la technologie récente d'édition de base par le système CRISPR/Cas9 qui offre la possibilité unique, grâce à une enzyme Cas9 inactive fusionnée à un éditeur de base, de corriger certaines mutations ponctuelles sans induire de cassures double brin de l'ADN, minimisant le risque de mutagenèse hors cible. Nous ciblerons en particulier la correction locale de la mutation Gly>Arg via édition de base par l'adénosine désaminase.
Parmi les mutations responsables du lymphoedème primaire, nous sélectionnerons trois gènes dont les mutations autosomales dominantes sont compatibles avec cette approche : Le gène FLT4, codant le récepteur VEGFR3, essentiel à la morphogenèse et au maintien des vaisseaux lymphatiques (congénial 3122G>A), le gène FOXC2, responsable du maintien des valves lymphatiques (intermédiaire 362G>A), et le gène EPHB4, impliqué dans la hierarchisation du réseau lymphatique (Tardif 1973G>A).

La thèse sera répartie en trois objectifs : 1/ Cloner la mutation des gènes cibles et identifier les ARN guides pour le système CRISPR/Cas9. 2/ tester les mutations +/- edition sur des cultures primaires de cellules endothéliales lymphatique in vitro, et 3/ tester les mutations +/- edition in vivo localement à l'aide de lentivirus sur la patte de souris.

Cette étude représentera la première approche combinant édition de base ciblée par CRISPR/Cas9 et thérapie régénérative dans le lymphoedème primaire. Elle permettra la correction locale d'une mutation rare avec minimisation des effets secondaires systémiques en utilisant des modèles in vitro et in vivo innovants développés d'un laboratoire possédant une expertise reconnue dans la biologie vasculaire lymphatique et les approches de régénération tissulaire par thérapie génique. Ce projet combine des techniques établies de clonage, lentivecteurs, et ARN thérapeutiques.
Ce projet apportera une preuve de concept pour une thérapie curative du lymphoedème primaire et pourrait être étendu à d'autres pathologies génétiques du système lymphatique. La combinaison édition de base et de la régénération tissulaire pourrait constituer un nouveau paradigme pour le traitement de maladies vasculaires rares jusqu'ici incurables.
Le lymphoedème primaire est une pathologie génétique rare résultant d'anomalies du développement et du fonctionnement du système lymphatique, conduisant à un défaut chronique de drainage, une accumulation de liquide interstitiel et de tissu adipeux dans les membres, ainsi qu'à une inflammation persistante et une fibrose progressive du derme. Plus de trente gènes impliqués dans la morphogenèse, l'organisation et le maintien des vaisseaux lymphatiques ont été associés à cette maladie, donnant lieu à des formes congénitales, intermédiaires ou tardives selon l'âge d'apparition. À ce jour, les traitements disponibles restent essentiellement symptomatiques et ne permettent pas de corriger la cause génétique sous-jacente. En parallèle, des avancées récentes en thérapie génique et en médecine régénérative ont ouvert de nouvelles perspectives, notamment grâce aux approches par ARN messager pro-lymphangiogéniques et anti-fibrotiques développées pour le lymphoedème secondaire post-cancer. Dans ce contexte, l'émergence des technologies d'édition de base dérivées du système CRISPR/Cas9 offre la possibilité inédite de corriger des mutations ponctuelles de manière ciblée sans induire de cassures double brin de l'ADN, réduisant considérablement les risques d'effets hors cible. L'association de cette stratégie de correction génétique locale avec une thérapie régénérative par ARNm représente ainsi une approche innovante et prometteuse pour envisager, pour la première fois, un traitement à visée curative du lymphoedème primaire. La thèse sera répartie en trois objectifs : 1/ Cloner la mutation des gènes cibles et identifier les ARN guides pour le système CRISPR/Cas9. 2/ tester les mutations +/- edition sur des cultures primaires de cellules endothéliales lymphatique in vitro, et 3/ tester les mutations +/- edition in vivo localement à l'aide de lentivirus sur la patte de souris. L'ARN messager codant pour le transgène sera encapsidé dans un vecteur viral intégratif de type lentivecteur afin de transduire des cultures primaires de cellules endothéliales lymphatiques (CEL) humaines à un passage précoce qui exprimeront de manière stable le transgène. Un contrôle avec un lentivecteur vide sera inclus dans chaque expérience. A chaque passage, l'expression du transgène sera évaluée par quantification absolue de l'ARN messager par RT-ddPCR ainsi qu'au niveau protéique par Western Blot.

L'impact de la mutation sera ensuite étudié in vitro sur la migration, la prolifération, la tubulogenèse des cellules endothéliales lymphatiques ainsi que sur la perméabilité de vaisseaux sur puces disponibles au laboratoire.
La mutation sera corrigée à l'aide de nanoparticules délivrant l'éditeur de base Cas9-adénosine désaminase/ARN guide. La correction et les effets hors cible seront quantifiés par rhAmpSeq, une technique de séquençage à haut débit permettant de détecter spécifiquement les éditions de base.
Enfin les lentivecteurs permettant l'expression des gènes mutés porteur de la mutation seront introduit localement dans la patte de souris (injections intradermiques). L'évolution lymphatique sera évaluée par mesures volumétriques, lymphographies et analyses histologiques. Ce modèle servira de plateforme préclinique pour tester les stratégies thérapeutiques par edition du genome in vivo à l'aide de lentivecteurs.

Biologie moléculaire, thérapie génique et expérimentation animale.