Thèse Intégrer la Topologie de l'Adn dans les Mécanismes de Formation des Cassures Double Brin de l'Adn Dépendantes de la Transcription H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Toulouse École doctorale : BSB - Biologie, Santé, Biotechnologies Laboratoire de recherche : CRCT - Centre de Recherches en Cancérologie de Toulouse Direction de la thèse : Olivier SORDET ORCID 0000000160274925 Début de la thèse : 2027-09-01 Date limite de candidature : 2026-11-23T23:59:59 Les dommages à l'ADN associés à la transcription constituent une source importante d'instabilité génomique. Au cours de la transcription, l'ARN polymérase II génère des contraintes topologiques dans l'ADN qui doivent être relâchées par les ADN topoisomérases, notamment TOP1 et TOP2. Des travaux récents du Partenaire 2 (Karolinska Institutet, Stockholm, Suède) ont identifié le « topoisome », un complexe associé à la transcription contenant TOP1, TOP2 et la protéine oncogénique/régulatrice de la transcription MYC. Au sein du topoisome, MYC stimule l'activité des topoisomérases afin de contrôler une transcription à haut débit. Cependant, la manière dont cette régulation de la topologie de l'ADN contribue à la formation de cassures double-brin de l'ADN (DSBs), qui constituent les lésions génomiques les plus délétères, reste mal comprise.

Les travaux du Partenaire 1 (CRCT, Toulouse, France) ont montré que le piégeage de la TOP1 sur l'ADN sous forme de complexes de clivage (TOP1cc) induit des DSBs dépendantes de la transcription dans des cellules non réplicatives. Sur le plan mécanistique, ces DSBs résultent de deux cassures simple-brin (SSB) proches, situées sur des brins opposés de l'ADN : l'une est générée lors de l'élimination des TOP1cc, tandis que l'autre résulte du clivage des R-loops par des nucléases telles que XPF. Ces DSBs dépendantes de la transcription sont impliquées dans des pathologies humaines et ont notamment été associées à la neurodégénérescence ainsi qu'à l'acquisition de résistances aux thérapies ciblées contre le cancer. Des données préliminaires du Partenaire 1 identifient désormais TOP2 comme un facteur supplémentaire nécessaire à la formation des DSBs consécutives au piégeage de la TOP1. L'activité catalytique de TOP2 est requise pour ce processus, et TOP2 interagit avec XPF afin de favoriser le clivage des R-loops.

Associées à l'identification du topoisome par le Partenaire 2, ces observations suggèrent que le topoisome pourrait coordonner les activités de TOP1 et TOP2 au cours de la transcription afin de favoriser la formation de DSBs en réponse au piégeage de la TOP1. Nous émettons l'hypothèse que le piégeage de la TOP1 modifie localement la topologie de l'ADN et favorise la formation de R-loops. Ces R-loops deviennent à leur tour des substrats pour le clivage dépendant de XPF. TOP2 pourrait faciliter ce processus en régulant localement la topologie de l'ADN et en favorisant le clivage des R-loops dépendant de XPF. Ce clivage générerait une seconde SSB qui, associée à la SSB liée aux TOP1cc, conduirait finalement à la formation d'une DSB.

Le projet visera à tester ce modèle à l'aide d'approches génétiques, pharmacologiques, génomiques et moléculaires. Le doctorant déterminera comment l'activité de TOP2 au sein du topoisome répond au piégeage de TOP1, comment les modifications de la topologie de l'ADN influencent la formation et la résolution des R-loops, et comment ces événements contribuent à la formation de DSBs. Des manipulations génétiques et pharmacologiques des composants du topoisome, des voies de réparation des TOP1cc et du traitement des R-loops, combinées à des approches à l'échelle du génome ainsi qu'à des analyses cellulaires et moléculaires, permettront de définir les mécanismes reliant l'activité du topoisome, la topologie de l'ADN et la formation des DSBs.

En établissant le lien entre la topologie de l'ADN associée à la transcription, la prise en charge des R-loops et la formation des DSBs, ce projet collaboratif apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes à l'origine de l'instabilité génomique associée à la transcription et sur leur implication dans les maladies humaines. Transcription generates DNA torsional stress that must be controlled to allow RNA polymerase II to progress. DNA topoisomerases, particularly TOP1 and TOP2, relieve this stress by relaxing DNA. To relax DNA, TOP1 transiently generates TOP1-associated DNA single-strand breaks (SSBs), whereas TOP2 transiently generates TOP2-associated DNA double-strand breaks (DSBs). Partner 2 (Laura Baranello, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden) recently identified the topoisome, a transcription-associated complex containing TOP1, TOP2 and the oncoprotein and transcription factor MYC. Within the topoisome, MYC stimulates TOP1 and TOP2 activities to coordinate DNA topology with transcription activation (1-3).

When TOP1 becomes trapped on DNA as a cleavage complex (TOP1cc) by the TOP1 inhibitor camptothecin, its normal activity is blocked and transcription is arrested. This can favor the formation of R-loops, in which the newly synthesized RNA hybridizes with the DNA template, displacing one DNA strand. R-loops can help relieve local topological stress but also create structures that are susceptible to cleavage and can therefore contribute to DNA damage. Previous work from Partner 1 (Olivier Sordet, CRCT, Toulouse, France) showed that TOP1ccs unexpectedly promote transcription-dependent DSBs in non-replicating cells. These DSBs result from two nearby SSBs on opposite DNA strands: one generated during TOP1cc removal and the other caused by cleavage of R-loops by nucleases such as XPF (4). These transcription-dependent DSBs are relevant to human disease, as Partner 1 has further implicated them in a neurodegenerative disorder (5) and in the acquisition of resistance to targeted therapies in cancer (6).

Preliminary data from Partner 1 identified TOP2 as an additional factor required for the formation of these transcription-dependent DSBs. An siRNA screen revealed that knockdown of TOP2 strongly reduces DSB formation following TOP1 trapping. Further preliminary results indicate that TOP2 catalytic activity is required for this process and that TOP2 interacts with the nuclease XPF to promote R-loop cleavage. These findings suggest that TOP2 may link the control of DNA topology to R-loop processing following TOP1 trapping. Together with the identification of the topoisome by Partner 2, these findings lead us to hypothesize that the MYC-driven topoisome coordinates TOP1 and TOP2 activities during transcription. Following TOP1 trapping, the local DNA topology is altered and this triggers R-loop formation. TOP2 recruits XPF to resolve the R-loop and restore transcription. TOP2 activity may contribute to this process by controlling local DNA topology and promoting XPF-dependent R-loop cleavage, ultimately contributing to DSB formation (Figure 1, see attached PDF file). Partner 1 - CRCT, Toulouse (Olivier Sordet)
Partner 1 will investigate the molecular mechanisms underlying transcription-associated DNA double-strand break (DSB) formation using complementary genetic, pharmacological, imaging and molecular approaches. CRISPR and RNA interference, together with pharmacological approaches including MYC degraders, will be used to manipulate key components of the topoisome and factors involved in TOP1cc repair and R-loop processing. High-content microscopy and Comet assays will be used to analyse DNA damage, while DRIP-based approaches will be used to investigate R-loops. Proximity-based assays (PLA), protein and R-loop immunoprecipitation, and chromatin-based approaches will be used to characterize the interactions between TOP1, TOP2, MYC, XPF and R-loop-associated factors.

Partner 2 - Karolinska Institutet, Stockholm (Laura Baranello)
Partner 2 will complement the aforementioned approaches by applying genomic mapping of the topoisome, TOP1cc, TOP2cc, MYC and XPF, to assess the binding and activity of these factors at genes. Nascent RNA sequencing will measure the consequences of TOP1 trapping and DSB formation on the transcription process. Cross-correlating these datasets will reveal the relationship between transcription, DNA topology and DNA repair in non-proliferating cells. Partner 2 will also provide cell systems enabling acute degradation of MYC and topoisomerases, providing orthogonal approaches to siRNA knockdown.

L'étudiant en doctorat sera principalement accueilli dans le laboratoire d'Olivier Sordet au CRCT à Toulouse (Partenaire 1), où seront réalisés les principaux travaux expérimentaux. Des séjours de recherche dans le laboratoire de Laura Baranello au Karolinska Institutet à Stockholm (Partenaire 2) seront organisés pour des analyses spécifiques du topoisome et pour les approches génomiques.

L'étudiant participera aux réunions hebdomadaires du laboratoire avec le Partenaire 1 afin de discuter des résultats expérimentaux, de résoudre les problèmes rencontrés lors des expériences et de planifier les prochaines étapes. Des réunions conjointes entre les Partenaires 1 et 2 seront organisées chaque mois en visioconférence afin de faire le point sur l'avancement du projet, de discuter des résultats et d'ajuster la stratégie de recherche si nécessaire. L'étudiant bénéficiera d'une formation pratique aux approches expérimentales utilisées dans les deux laboratoires, ainsi que d'une formation à l'analyse des données, à la communication scientifique écrite et orale et à d'autres compétences transversales pertinentes pour la formation doctorale.

Application link: https://edd-projets.utoulouse.fr/