Thèse Mécanismes Épigénétiques Impliquant le Complexe Wrad Wdr5-Rbbp5-Ash2l-Dpy30 dans la Résistance aux Anticorps Conjugués à des Inhibiteurs de la Topoisomérase I dans le Cancer du Sein H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health École doctorale : Cancérologie : Biologie - Médecine - Santé Laboratoire de recherche : Intégrité du Génome et Cancers Direction de la thèse : Patricia KANNOUCHE ORCID 0000000260503457 Début de la thèse : 2026-11-02 Date limite de candidature : 2026-11-03T23:59:59 Les anticorps conjugués à une drogue (ADC) délivrant un inhibiteur de topoisomérase I (DXd, SN-38), tels que le Patritumab deruxtecan (HER3-DXd) ou le trastuzumab déruxtécan (HER2-DXd), ont transformé le traitement du cancer du sein métastatique, y compris en contexte HER2-low. La résistance, primaire ou acquise, reste cependant quasi systématique et ses déterminants moléculaires sont mal caractérisés, en particulier sur le plan épigénétique.
Un crible CRISPR-Cas9 génome entier (librairie TKOv3), réalisé en cellules SK-BR-3 (HER2+) à concentration sublétale de DXd dans le cadre du programme ICARUS (Gustave Roussy), a identifié de façon convergente les quatre sous-unités du complexe WRAD (WDR5, RBBP5, ASH2L, DPY30) comme déterminants de résistance. WRAD est le module co-activateur obligatoire des méthyltransférases de H3K4 de la famille KMT2/COMPASS, aucune de ses sous-unités n'étant catalytique isolément. Ce résultat suggère un effet du complexe plutôt que de sous-unités isolées, mais n'indique ni la méthyltransférase KMT2 impliquée, ni la part de ses fonctions canoniques (méthylation de H3K4) et non canoniques (WDR5 : MYC, mitose, complexe PRC1.6).
L'hypothèse centrale est que la perte de WRAD confère une résistance en modifiant la réponse cellulaire aux lésions de l'ADN induites par les inhibiteurs de topoisomérase I (complexes de clivage TOP1-ADN et leurs collisions avec les fourches de réplication), plutôt qu'en altérant l'expression ou l'internalisation de la cible de l'ADC.
Trois mécanismes non exclusifs seront testés :
(i) une diminution de la proportion de cellules en phase S, limitant la formation de lésions dépendantes de la réplication ;
(ii) une protection des fourches de réplication bloquées : la perte de la méthylation de H3K4 aux fourches limiterait le recrutement des nucléases MRE11 et MUS81 et la dégradation de l'ADN naissant, comme décrit pour PTIP/KMT2C/D et EZH2 dans les cellules déficientes pour BRCA (Ray Chaudhuri et al., Nature 2016 ; Rondinelli et al., Nat Cell Biol 2017) ;
(iii) une baisse d'expression de SLFN11, facteur de sensibilité aux inhibiteurs de topoisomérase I, résultant de la perte de l'activité de la déméthylase de H3K27me3 UTX/KDM6A, associée aux complexes KMT2C/D et antagoniste d'EZH2.
Le projet s'articule en cinq étapes :
(1) analyse in silico de la dépendance fonctionnelle de WRAD (DepMap), construction d'un score d'expression WRAD et analyse des données publiques (TCGA) et des données de séquençage (WES, RNA-seq) de la cohorte ICARUS, afin d'évaluer l'association entre WRAD et la réponse aux inhibiteurs de TOP1 ;
(2) validation de la résistance par invalidation CRISPR-Cas9 des quatre sous-unités (ou au moins deux simultanément) et restauration de leur expression (rescue), avec contrôle de l'expression et de l'internalisation de HER2 ;
(3) caractérisation mécanistique : cycle cellulaire, marqueurs de lésions de l'ADN, dynamique des fourches (DNA fiber assay), recrutement de MRE11 et MUS81, expression et régulation épigénétique de SLFN11, identification de la méthyltransférase KMT2 impliquée ;
(4) A partir d'analyses RNA-seq, ATAC-seq and CUT&Tag, identification du programme transcriptionnel et de l'état de la chromatine suite à un défaut du complexe WRAD après traitement à l'ADC. Les cellules parentales seront utilisées en contrôle.
(5) validation dans des modèles complémentaires (autres lignées, Patient-derived organoides) et corrélation avec la réponse clinique dans ICARUS.
Les inhibiteurs de TOP1 stabilisent les complexes de clivage TOP1-ADN. Leur rencontre avec les fourches de réplication peut convertir ces lésions en cassures de l'ADN [8]. La cytotoxicité dépend donc de l'engagement réplicatif et du traitement des fourches bloquées, au-delà de l'exposition au payload. La chromatine peut intervenir par la régulation transcriptionnelle de la réplication et de la réparation, mais également par le recrutement local de protéines aux fourches. SLFN11 fournit un précédent : il bloque les fourches soumises au stress par un mécanisme distinct de la signalisation ATR [9]. Dans des modèles de cancer pulmonaire à petites cellules, sa répression par l'axe EZH2-H3K27me3 contribue à la résistance à la chimiothérapie [10]. Ces observations justifient l'hypothèse épigénétique, sans démontrer sa transposition aux ADC-DXd dans le cancer du sein.
Un crible CRISPR-Cas9 génome entier avec la librairie TKOv3, réalisé dans les cellules SK-BR-3 HER2 positives exposées au DXd libre à une concentration sublétale (IC20), a identifié WDR5, RBBP5, ASH2L et DPY30 parmi les candidats dont l'inactivation favorise la résistance. La convergence des quatre sous-unités de WRAD suggère un effet du module, à confirmer par des perturbations indépendantes et des expériences de restauration. Le crible portant sur le payload libre, la transposition à l'ADC intact reste à établir.
WRAD participe aux complexes SET1/KMT2 responsables de la méthylation de H3K4 [11]. Son altération pourrait modifier les programmes transcriptionnels de réplication et de réponse aux dommages. Les contributions des différentes marques H3K4 et enzymes catalytiques seront distinguées des fonctions non canoniques des sous-unités. Une invalidation génétique de WRAD ne suffira pas à qualifier la résistance d'épigénétique : le lien causal entre modification chromatinienne et phénotype devra être établi, avec recherche de réversibilité. KMT2C/D sont notamment associés à H3K4me1 aux enhancers, tandis que SETD1A/B contribuent à H3K4me3 aux promoteurs. Cette diversité interdit d'assimiler la perte de WRAD à une modification uniforme de la chromatine.
Dans des modèles déficients pour BRCA1/2, l'altération de l'axe PTIP-MLL3/4-KMT2C/D réduit le recrutement de MRE11 et la dégradation des fourches [12]. Un mécanisme distinct implique EZH2, H3K27me3 et le recrutement de MUS81 [13]. Ces travaux fondent l'étude du traitement des fourches après altération de WRAD, mais leur extrapolation au DXd reste hypothétique et devra tenir compte du statut BRCA et de la recombinaison homologue. La protection de l'ADN naissant et le redémarrage des fourches devront être mesurés directement. Une diminution des marqueurs de dommages peut refléter une moindre fraction réplicative et ne démontrera pas, isolément, une meilleure protection des fourches.
Nous proposons que l'altération de WRAD induit un état chromatinien et réplicatif limitant la conversion des lésions TOP1 en dommages létaux. Trois mécanismes non exclusifs seront testés : réduction de l'engagement en phase S, modification du traitement des fourches et modulation de SLFN11. Les analyses contrôleront la prolifération et la survie durable ; la comparaison DXd libre/T-DXd, avec mesure de HER2 et de l'internalisation, situera le mécanisme dans la chaîne d'action de l'ADC.
Objectif principal : déterminer si l'altération du complexe WRAD induit une résistance aux ADC à payload inhibiteur de TOP1 par modification de l'état épigénétique et de la réponse au stress réplicatif.
1. Confirmer le rôle causal des quatre sous-unités dans la réponse au DXd libre et établir la transposition du phénotype aux ADC, en contrôlant la prolifération et la délivrance du médicament.
2. Distinguer les contributions du ralentissement réplicatif, du traitement des lésions TOP1 et de la protection ou du redémarrage des fourches.
3. Identifier les programmes transcriptionnels et les marques chromatiniennes impliqués, les enzymes SET1/KMT2 pertinentes et la dépendance éventuelle à SLFN11.
4. Évaluer la généralisation à d'autres modèles de cancer du sein et explorer l'association entre l'état WRAD et la réponse clinique aux ADC-DXd, afin de proposer une signature candidate et des pistes de re-sensibilisation.
Le projet sera conduit sur trois ans. Les six premiers mois seront consacrés à la validation initiale du rôle de WRAD dans la réponse au DXd. Les résultats de cette première étape guideront les analyses mécanistiques et translationnelles ultérieures.

Axe 1 - Validation fonctionnelle du rôle de WRAD
Des modèles cellulaires de cancer du sein présentant une diminution de l'expression ou une inactivation des sous-unités de WRAD seront étudiés, en partant du modèle SK-BR-3 utilisé dans le crible initial. Leur réponse au DXd libre sera comparée à celle de cellules témoins, puis la transposition du phénotype au T-DXd sera évaluée. Les analyses prendront en compte la prolifération, la viabilité et la survie après traitement. L'expression de HER2 et l'internalisation de l'ADC seront également examinées pour rechercher un effet sur la délivrance du médicament. Des perturbations indépendantes et, lorsque cela sera réalisable, la réexpression de la sous-unité ciblée permettront de renforcer le lien causal entre WRAD et le phénotype observé.
Axe 2 - Étude de la réplication et des dommages de l'ADN
Dans les modèles validés, nous rechercherons si l'altération de WRAD modifie le cycle cellulaire et la réponse aux lésions induites par le DXd. L'étude des complexes TOP1-ADN et de marqueurs de dommages permettra de situer l'effet de WRAD dans la réponse au traitement. Des analyses sur fibres d'ADN seront utilisées pour caractériser la progression, la stabilité et le redémarrage des fourches de réplication. Ces résultats seront interprétés en tenant compte des différences de prolifération et du contexte de réparation de l'ADN des modèles.
Axe 3 - Caractérisation du mécanisme épigénétique et lien avec SLFN11
Des analyses transcriptomiques et de marques chromatiniennes, notamment la méthylation de H3K4, permettront d'identifier les programmes modifiés après perturbation de WRAD. Les candidats associés à la réplication et à la réponse aux dommages seront ensuite étudiés fonctionnellement. L'expression de SLFN11 et sa contribution au phénotype seront examinées, sans présumer que la résistance dépend de ce facteur. L'objectif sera de relier les modifications de la chromatine à la réponse au DXd et de distinguer leur contribution d'un simple ralentissement de la croissance cellulaire.
Axe 4 - Caractérisation du programme trancriptionnel et épigénétique suite à un défaut du complexe WRAD
A partir d'analyses RNA-seq, ATAC-seq and CUT&Tag, identification du programme transcriptionnel et de l'état de la chromatine suite à un défaut du complexe WRAD avant/après traitement à l'ADC. Les cellules parentales seront utilisées en contrôle.

Axe 5 - Validation dans d'autres modèles et exploration translationnelle
Les principaux résultats seront évalués dans des modèles complémentaires de cancer du sein afin d'en apprécier la généralisation. En parallèle, les bases pharmacogénomiques publiques permettront d'explorer les relations entre WRAD et la sensibilité aux inhibiteurs de TOP1. Les données moléculaires et cliniques disponibles d'ICARUS-BREAST01 seront utilisées pour rechercher des associations entre WRAD, les programmes identifiés et la réponse au HER3-DXd. Ces analyses resteront exploratoires et tiendront compte des différences de cible et de sous-type tumoral par rapport aux modèles expérimentaux. Les éventuelles stratégies de resensibilisation seront choisies selon le mécanisme mis en évidence.
Les résultats expérimentaux reposeront sur des répétitions biologiques indépendantes et des contrôles adaptés. Les analyses statistiques prendront en compte la variabilité entre expériences et les différences de croissance. Les analyses omiques intégreront les effets de lot et les comparaisons multiples ; les analyses cliniques seront adaptées aux effectifs disponibles. Les modalités expérimentales précises seront définies avec l'encadrement scientifique et ajustées aux résultats de la validation initiale.

Candidat(e) ayant une expertise en épigénétique et en biologie du cancer, très motivé(e) et rigoureux.se.