Thèse Synthèse des Purines chez Mycobacterium Abscessus Exploration de Nouvelles Cibles Thérapeutiques et Criblage de Molécules Inhibitrices H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Montpellier
École doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
Laboratoire de recherche : IRIM - Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier
Direction de la thèse : Wassim DAHER ORCID 0000000190265333
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-11T23:59:59

La tuberculose et les infections à mycobactéries non tuberculeuses, telles que Mycobacterium abscessus, représentent un défi majeur de santé publique, nécessitant de nouvelles stratégies thérapeutiques. La synthèse de novo des purines, essentielle pour la production des nucléotides, a récemment été validée comme cible pharmacologique prometteuse chez Mycobacterium tuberculosis, notamment avec l'inhibition de l'enzyme PurF (amidophosphoribosyltransférase) démontrant une activité bactéricide in vitro et in vivo. Ce projet vise à étudier la voie de biosynthèse des purines chez M. abscessus, en se concentrant sur les enzymes clés GuaB2 (Inosine monophosphate déshydrogénase), PurA (adénylosuccinate synthétase), PurF1 et PurF2 (amidophosphoribosyltransférase), et PurH (protéine bifonctionnelle de biosynthèse des purines), afin d'évaluer leur potentiel comme cibles thérapeutiques.
Pour ce faire, nous générerons des mutants inducibles de M. abscessus en utilisant les approches tetOFF et CRISPRi, permettant d'étudier l'essentialité de chaque enzyme dans des conditions contrôlées. Les mutants seront caractérisés à l'aide d'analyses phénotypiques, incluant l'évaluation de la croissance, de la viabilité et de la capacité à synthétiser les nucléotides. En parallèle, nous produirons les enzymes cibles sous forme de protéines recombinantes pour mesurer la force et la spécificité des interactions avec des inhibiteurs potentiels, et pour réaliser des études biochimiques détaillées concernant leurs activités enzymatiques spécifiques en présence de leurs substrats.
Un criblage de banques de composés sera effectué afin d'identifier des molécules inhibitrices ciblant ces enzymes essentielles, avec validation des candidats par des essais enzymatiques, thermal shift assays et tests in vitro de concentration minimale inhibitrice. Les composés les plus prometteurs seront ensuite évalués in cellulo dans des macrophages humains de type THP-1 ou des macrophages primaires infectés par M. abscessus et, le cas échéant, dans des modèles animaux (poisson zèbre et souris), fournissant une base solide pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
En combinant la génétique, la biochimie et le criblage de molécules, ce projet permettra non seulement de cartographier la vulnérabilité de la voie de biosynthèse des purines chez M. abscessus, mais aussi d'identifier des inhibiteurs potentiels à fort intérêt pharmacologique, ouvrant la voie à de nouvelles approches contre les mycobactéries résistantes aux traitements actuels.

Les infections à mycobactéries, en particulier la tuberculose causée par Mycobacterium tuberculosis et les infections non tuberculeuses à Mycobacterium abscessus, constituent un défi majeur pour la santé publique en raison de leur résistance croissante aux traitements actuels et de la durée prolongée des thérapies existantes. Les approches thérapeutiques conventionnelles sont souvent insuffisantes, ce qui souligne l'urgence de découvrir de nouvelles cibles moléculaires essentielles pour le développement de traitements innovants.
La biosynthèse de novo des purines, voie métabolique indispensable à la production des nucléotides, a récemment été validée comme cible pharmacologique prometteuse chez M. tuberculosis. L'inhibition de l'enzyme PurF (amidophosphoribosyltransférase), première étape engagée de cette voie, a démontré une activité bactéricide significative in vitro et in vivo, confirmant le potentiel thérapeutique de cette approche. Ces résultats suggèrent que d'autres enzymes clés de cette voie, telles que GuaB2 (inosine monophosphate déshydrogénase), PurA (adénylosuccinate synthétase), PurF1 et PurF2 (amidophosphoribosyltransférase) et PurH (protéine bifonctionnelle de biosynthèse des purines), pourraient également représenter des cibles essentielles chez M. abscessus.
Malgré l'importance de cette voie métabolique, la connaissance des enzymes de la biosynthèse purinique chez M. abscessus reste limitée, sur le plan fonctionnel, et peu d'inhibiteurs spécifiques ont été identifiés. L'essentialité de ces enzymes et leur vulnérabilité face à des inhibiteurs chimiques doivent être explorées afin de développer des stratégies thérapeutiques ciblées. Les technologies modernes, telles que la génération de mutants inductibles via tetOFF ou CRISPRi, la production de protéines recombinantes et les techniques de criblage de composés à haut débit, offrent désormais les outils nécessaires pour combler ces lacunes et identifier de nouvelles molécules antibactériennes à fort potentiel.
Ce projet s'inscrit donc dans un cadre scientifique novateur combinant microbiologie pathogène, biologie moléculaire et biochimie, avec pour objectif de cartographier la vulnérabilité métabolique de M. abscessus, de valider des cibles enzymatiques essentielles et de proposer des inhibiteurs potentiellement transposables en thérapies innovantes contre les mycobactéries résistantes.

Le projet vise à explorer la biosynthèse de novo des purines chez Mycobacterium abscessus, une mycobactérie non tuberculeuse présentant un fort enjeu clinique, afin d'identifier et de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. Il s'articule autour de plusieurs objectifs complémentaires : tout d'abord, caractériser fonctionnellement les enzymes clés du métabolisme purinique; GuaB2 (inosine monophosphate déshydrogénase), PurA (adénylosuccinate synthétase), PurF1 et PurF2 (amidophosphoribosyltransférase) et PurH (protéine bifonctionnelle de biosynthèse des purines); en évaluant leur rôle dans la croissance, la viabilité et la capacité de synthèse des nucléotides, grâce à la génération de mutants inductibles via les systèmes tetOFF et CRISPRi. Parallèlement, les enzymes cibles seront produites sous forme de protéines recombinantes pour mesurer la force et la spécificité des interactions avec des inhibiteurs potentiels et réaliser des analyses biochimiques détaillées de leur activité enzymatique. Ensuite, un criblage de bibliothèques de composés sera effectué pour identifier des molécules inhibitrices, dont l'efficacité sera validée par des essais enzymatiques, des thermal shift assays et la détermination de la concentration minimale inhibitrice in vitro. Les candidats les plus prometteurs seront ensuite testés dans des modèles cellulaires infectés, tels que les macrophages humains THP-1 ou primaires, et, si pertinent, dans des modèles animaux, comme le poisson zèbre ou la souris, afin d'évaluer leur potentiel thérapeutique. Enfin, l'ensemble de ces approches permettra de cartographier la vulnérabilité de la voie de biosynthèse des purines chez M. abscessus, d'identifier des cibles enzymatiques essentielles et de proposer des inhibiteurs à fort intérêt pharmacologique, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies innovantes contre les mycobactéries résistantes aux traitements actuels.

Le projet combine des approches de microbiologie, de biologie moléculaire, de biochimie et de pharmacologie pour étudier la biosynthèse de novo des purines chez Mycobacterium abscessus et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les bactéries seront cultivées en phase exponentielle dans des milieux Middlebrook 7H9 et 7H10, préparées et homogénéisées pour garantir une infection uniforme, tandis que les macrophages humains THP-1 ou primaires seront différenciés en cellules adhérentes à l'aide de PMA et d'autres facteurs de croissance et de différenciation. Des mutants inductibles ciblant les enzymes clés GuaB2 (inosine monophosphate déshydrogénase), PurA (adénylosuccinate synthétase), PurF1 et PurF2 (amidophosphoribosyltransférase) et PurH (protéine bifonctionnelle de biosynthèse des purines) seront générés via les approches tetOFF et CRISPRi, permettant d'étudier l'essentialité de chaque enzyme dans des conditions contrôlées, avec évaluation phénotypique de la croissance, de la viabilité et de la production de nucléotides. En parallèle, les enzymes cibles seront produites sous forme de protéines recombinantes, afin de mesurer la force et la spécificité des interactions avec des inhibiteurs potentiels et de réaliser des études biochimiques détaillées de leur activité catalytique, incluant des tests enzymatiques avec substrats spécifiques et des analyses de régulation allostérique. Des criblages de bibliothèques de petites molécules seront ensuite effectués pour identifier des inhibiteurs, validés par des essais enzymatiques, des thermal shift assays et la détermination de la concentration minimale inhibitrice in vitro. Les candidats les plus prometteurs seront testés in cellulo dans des macrophages infectés et, si pertinent, dans des modèles animaux tels que le poisson zèbre ou la souris, afin d'évaluer leur efficacité sur la survie bactérienne et leur potentiel thérapeutique. L'ensemble de ces approches intégrées permettra de cartographier les vulnérabilités métaboliques de M. abscessus, de valider des cibles enzymatiques essentielles et d'identifier des inhibiteurs à fort intérêt pharmacologique pour le développement de nouvelles stratégies antibactériennes innovantes.

Le candidat doit être titulaire d'un Master 2 ou d'un diplôme équivalent (ingénieur, pharmacien ou médecin). Des connaissances solides en biologie moléculaire, biologie cellulaire et microbiologie sont indispensables, avec une première expérience souhaitable dans la culture de mycobactéries ou la manipulation de pathogènes opportunistes. Des compétences en génétique bactérienne (CRISPRi, systèmes tetOFF), en expression de protéines recombinantes et en biochimie enzymatique constituent un atout majeur. Une expérience dans l'utilisation de modèles animaux (souris, poisson zèbre) pour l'étude de l'infection ou l'évaluation de candidats thérapeutiques sera également valorisée. Le candidat doit être capable de concevoir et d'analyser des expériences complexes, de traiter et interpréter des données expérimentales, et de rédiger des résultats scientifiques avec rigueur. Autonomie, esprit critique, sens de l'organisation et aptitude à travailler dans un environnement multidisciplinaire sont essentiels, tout comme la capacité à communiquer efficacement ses résultats à l'oral et à l'écrit au sein d'équipes académiques et industrielles internationales.