Thèse Spécificités Fonctionnelles des Exoenzymes Bactériens de Type Exoy en Tant que Purinyl- et Pyridylyl Cyclases Études Biochimiques et Structurales H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Santé et médicaments École doctorale : Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué Laboratoire de recherche : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule Direction de la thèse : Pierre-Damien COUREUX ORCID 0000000213287229 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-04-28T23:59:59 L'AMP cyclique (cAMP) et le GMP cyclique (cGMP) sont des seconds messagers bien établis dans la signalisation cellulaire. En revanche, les nucléotides cycliques pyrimidiques non canoniques cUMP et cCMP restent mal compris, malgré des preuves claires de leur présence dans les cellules eucaryotes depuis plus de 15 ans [1]. Ce projet de thèse combine des approches biochimiques et structurales pour étudier des cyclases pyrimidiques bactériennes et leurs effecteurs, afin d'améliorer notre compréhension de la signalisation cUMP/cCMP et de soutenir le développement de biosenseurs dédiés.Les cyclases pyrimidiques bactériennes Pycsar (PycC), réparties en cinq clades, ont récemment été identifiées comme des composants clés de systèmes de défense anti-phages appelés système Pycsar (pyrimidine cyclase system for antiphage resistance) [2]. Les PycC synthétisent du cUMP ou du cCMP dans les bactéries infectées, activant des effecteurs qui déclenchent leur mort cellulaire lors d'une attaque par un phage. Toutefois, leurs propriétés enzymatiques, ainsi que leurs mécanismes d'activation et de régulation, restent largement inexplorés. En parallèle, les exotoxines de type ExoY, des nucléotidyl cyclases (NC) apparentées, sont des facteurs de virulence bactérienne qui, une fois injectés dans les cellules eucaryotes, sont activés par l'actine de l'hôte et génèrent de fortes quantités de nucléotides cycliques puriques (cAMP, cGMP) et pyrimidiques (cUMP, cCMP), perturbant les voies de signalisation de l'hôte [3-4]. La cytotoxicité et le rôle des toxines ExoY dans différentes infections bactériennes, ainsi que les fonctions du cUMP et du cCMP dans les cellules eucaryotes, demeurent mal compris.

Caractérisations enzymatiques : Des enzymes PycC et ExoY-like représentatives, issues de bactéries sélectionnées (p. ex. P. aeruginosa, E. coli, Vibrio vulnificus, Aeromonas schubertii), seront caractérisées sur le plan biochimique. Un test fluorescent au terbium-norfloxacine (TBN) sera optimisé afin de suivre en temps réel la conversion de nucléotides triphosphates puriques/pyrimidiques en nucléotides cycliques. Ce test permettra d'évaluer l'effet de cofacteurs, du pH et de l'état oligomérique sur l'activité, et d'identifier d'éventuels cofacteurs physiologiques des PycC. Si la sensibilité est suffisante, il servira à déterminer les spécificités de substrat et les propriétés enzymatiques de differents orthologues PycC et ExoY. Il sera aussi utilisé par des collaborateurs (chimistes du campus) pour cribler des bibliothèques de petites molécules à la recherche d'inhibiteurs des toxines NC de type ExoY, qui seront ensuite a caractériser.

Études structurales : Sur la base des données biochimiques, des analyses structurales à résolution atomique de PycC et d'orthologues ExoY seront menées par cristallographie aux rayons X (encadrement LR) et/ou cryo-microscopie électronique (encadrement PDC), afin d'élucider les bases moléculaires de la sélectivité de substrat et des mécanismes catalytiques. La dynamique conformationnelle et les états on/off d'un effecteur Pycsar lors de la liaison au cUMP/cCMP seront également étudiés.

Développement de biosenseurs cUMP/cCMP : Guidé par les données structurales ou des modèles prédits d'effecteurs Pycsar dépendants du cUMP/cCMP, le projet initiera l'étude in vitro et le développement de biosenseurs FRET spécifiques du cUMP et du cCMP, afin de suivre a plus long terme leur production et leur dynamique dans les cellules.

Perspectives : Une meilleure compréhension de la synthèse sélective du cUMP/cCMP par les NC PycC et ExoY, associée au développement de biosenseurs FRET spécifiques, contribuerait à faire progresser l'étude des voies de signalisation cUMP/cCMP, à répondre à l'enjeu de l'antibiorésistance (PycC), et à mieux caractériser les toxines ExoY, tout en évaluant leur potentiel comme cibles thérapeutiques.
L'AMP cyclique (AMPc) et le GMP cyclique (GMPc) sont des seconds messagers bien établis dans la signalisation cellulaire. En revanche, les nucléotides cycliques pyrimidiques non canoniques cUMP et cCMP restent mal compris, malgré des preuves évidentes de leur présence dans les cellules eucaryotes au cours des 15 dernières années [1]. Ce projet de doctorat combine des approches biochimiques et structurales pour étudier les pyrimidylcyclases bactériennes et leurs effecteurs, dans le but de faire progresser notre compréhension de la signalisation cUMP/cCMP et de soutenir le développement de biocapteurs pour ces molécules.

Les pyrimidine cyclases bactériennes Pycsar (PycC), classées en cinq clades, ont récemment été identifiées comme des composants clés des systèmes de défense contre les phages connus sous le nom de système Pycsar (système de pyrimidine cyclase pour la résistance aux phages) [2]. Les PycC synthétisent du cUMP ou du cCMP dans les bactéries infectées, activant ainsi des effecteurs qui déclenchent la mort cellulaire en cas d'attaque par un phage. Cependant, leurs propriétés enzymatiques ainsi que leurs mécanismes d'activation et de régulation restent largement inexplorés. Parallèlement, les exotoxines de type nucléotidylcyclase (NC) ExoY sont des facteurs de virulence bactérienne qui, une fois injectées dans des cellules eucaryotes, sont activées par l'actine de l'hôte pour générer des niveaux élevés de nucléotides cycliques puriques (AMPc, GMPc) et pyrimidiques (UMPc, CMPc), perturbant ainsi les voies de signalisation de l'hôte [3-4]. La cytotoxicité et la contribution des toxines ExoY aux infections bactériennes, ainsi que les rôles du cUMP et du cCMP dans les cellules eucaryotes, restent mal compris. Ce projet de thèse combine des approches biochimiques et structurales pour étudier les pyrimidylcyclases bactériennes atypiques et leurs effecteurs. Il vise à approfondir notre compréhension de la signalisation cUMP/cCMP, à soutenir le développement de biocapteurs pour ces nucléotides cycliques et à fournir des informations structurales sur les spécificités enzymatiques des toxines de type nucléotidylcyclase ExoY présentes dans de nombreuses protéobactéries pathogènes. À long terme, ces travaux visent à élucider les spécificités cytotoxiques de ces toxines et à clarifier leur rôle dans diverses infections bactériennes. Pour atteindre les objectifs décrits ci-dessus, le projet s'appuiera sur les principales approches techniques suivantes :
- Analyses bioinformatiques et structurales
- Expression et purification de protéines recombinantes, y compris le marquage des protéines pour les études biophysiques
- Ingénierie des protéines, y compris la conception de protéines chimériques visant à stabiliser les intermédiaires transitoires au cours de la réaction de cyclase catalysée par les toxines NC bactériennes activées par l'actine, et à développer des biocapteurs FRET spécifiques au cUMP/cCMP
- Analyses biochimiques et biophysiques fonctionnelles (dosage enzymatique fluorimétrique, cinétique de polymérisation de l'actine, tests d'auto-assemblage de l'actine, mesures d'affinité, caractérisation et modélisation hydrodynamiques)
- Cristallisation des protéines et détermination de leur structure par cristallographie aux rayons X et microscopie électronique
- Optimisation de tests colorimétriques in vitro compatibles avec le criblage à haut débit de bibliothèques de petites molécules afin d'identifier des inhibiteurs sélectifs de toxines, en collaboration avec des chimistes locaux (ICSN, sur le campus) et des partenaires de l'Institut Pasteur (Paris, France). Si le temps le permet, les composés prometteurs seront évalués à l'aide de tests fonctionnels et de toxicité, et étayés par des études structurales afin de guider l'optimisation itérative des mécanismes d'inhibition.

Master en biochimie, biologie structurale, biophysique, biologie ou microbiologie, avec d'excellents résultats académiques. Le/la candidat(e) devra avoir un bon esprit d'équipe et un fort intérêt pour l'étude in vitro des interactions macromoléculaires, de leur régulation, et des relations structure-fonction des protéines.
Toute expérience de recherche supplémentaire en lien avec le projet sera un atout (analyses bioinformatiques, biochimie, biophysique, biologie moléculaire, structurale ou cellulaire). Ces expériences et vos résultats académiques devront être clairement présentés dans le dossier de candidature. Merci d'indiquer également les noms et coordonnées de vos encadrants de stage/formation, avec les périodes concernées.