Thèse la Tétraspanine Cd9 à l'Interface Hôte-Pathogène Lors de l'Interaction Entre les Macrophages et Mycobacterium Abscessus H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Montpellier
École doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
Laboratoire de recherche : IRIM - Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier
Direction de la thèse : Wassim DAHER ORCID 0000000190265333
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-11T23:59:59

Mycobacterium abscessus (M. abscessus) est une bactérie opportuniste responsable d'infections respiratoires et extra-respiratoires, telles que des infections des tissus mous ou systémiques. Les maladies causées par ce pathogène sont principalement étudiées chez les individus immunodéprimés et chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce microorganisme opportuniste infecte chroniquement ces patients en persistant au sein des cellules de la réponse immunitaire innée, ce qui conduit à la formation d'un agrégat complexe de cellules immunitaires, dédié à la rétention locale de l'infection, connu sous le nom de granulome. La panoplie de mécanismes de virulence possédés par M. abscessus permet une persistance efficace dans la cellule hôte.
Alors que les mécanismes intracellulaires de virulence et de persistance sont largement étudiés dans la littérature, les facteurs cellulaires détournés pour l'adhésion et l'internalisation de la mycobactérie restent peu compris. L'une des voies par lesquelles M. abscessus pénètre dans les cellules hôtes est la phagocytose médiée par ligands ; ainsi, une famille de cibles prometteuse pour le développement de futures stratégies thérapeutiques est celle des tétraspanines, constituée de protéines transmembranaires déjà impliquées dans l'entrée d'autres bactéries.
Les tétraspanines sont une famille de protéines transmembranaires hautement conservées, présentes chez les eucaryotes multicellulaires, appelées dans la littérature TSPANS ou clusters de différenciation (CD), chacune portant un numéro spécifique. Ces protéines remplissent diverses fonctions telles que l'organisation membranaire, la signalisation, la fusion, l'adhésion et la migration cellulaire. Leur capacité à intervenir dans différents mécanismes cellulaires repose sur leur aptitude à interagir avec différents partenaires protéiques, à la fois extracellulaires et intracellulaires, formant ainsi des plateformes moléculaires.
Des données préliminaires montrent que, dans le contexte de l'infection par M. abscessus, le blocage d'un membre de la famille des tétraspanines, CD9, à l'aide d'anticorps entraîne une réduction significative du taux d'internalisation. De même, CD9 a été décrit comme un médiateur clé de l'adhésion et de l'entrée de Staphylococcus aureus ou de Neisseria meningitidis, puisque la pré-incubation des bactéries avec des peptides dérivés de CD9 réduit significativement leur capacité à être internalisées dans les cellules, probablement en saturant le ligand se liant à CD9. L'ensemble des données obtenues jusqu'à présent suggère que la plateforme CD9 pourrait, de manière directe ou indirecte, se situer à l'interface de l'interaction hôte-pathogène entre les cellules hôtes et M. abscessus.

En tenant compte de ces éléments, les recherches menées au cours du stage viseront à explorer l'implication de la plateforme CD9 dans l'adhésion et l'internalisation de M. abscessus dans des cellules THP-1. Le projet suivra trois objectifs afin de préciser le rôle de la tétraspanine CD9 : i) évaluer la perturbation de l'internalisation par pré-incubation de la bactérie avec des peptides dérivés de CD9 ou en infectant une lignée macrophagique déficiente en CD9 ; ii) suivre le recrutement et la dynamique de la tétraspanine au site de contact lors de l'absorption de M. abscessus ; iii) identifier les ligands bactériens potentiels qui se lient au complexe protéique CD9.

Mycobacterium abscessus est une bactérie opportuniste responsable d'infections respiratoires et extra-respiratoires, principalement chez les patients immunodéprimés ou atteints de mucoviscidose. Elle persiste au sein des macrophages, échappant à la réponse immunitaire innée, ce qui conduit à la formation de granulomes et à des infections chroniques difficiles à traiter. Les mécanismes intracellulaires de virulence et de survie de M. abscessus sont partiellement connus, mais les facteurs cellulaires exploités pour son adhésion et son internalisation restent mal caractérisés. Les tétraspanines, en particulier CD9, sont des protéines transmembranaires organisant la membrane cellulaire et formant des plateformes moléculaires qui peuvent être détournées par des bactéries pour pénétrer dans les cellules hôtes. Étudier l'interaction entre CD9 et les ligands bactériens de M. abscessus permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'infection et d'identifier de nouvelles cibles pour des stratégies thérapeutiques innovantes.

Le projet de recherche vise à explorer le rôle de la tétraspanine CD9 dans l'adhésion, l'entrée, l'internalisation et la survie de Mycobacterium abscessus dans les cellules THP-1. Trois objectifs principaux ont été définis. Le premier consiste à évaluer l'impact de CD9 sur l'adhésion, l'internalisation et la survie bactérienne en utilisant une lignée cellulaire THP-1 déficiente en CD9, générée par technologie CRISPR/Cas, et à comparer les résultats avec des cellules sauvages et une lignée complémentée, tout en testant l'effet d'un peptide dérivé de CD9 sur l'internalisation. Le deuxième objectif porte sur l'analyse de la dynamique spatiale et de la colocalisation de CD9 et des bactéries lors de l'internalisation, en utilisant une lignée THP-1 exprimant eGFP-CD9 et des bactéries fluorescentes, afin de suivre le recrutement de CD9 au site de contact. Enfin, le troisième objectif vise à identifier les ligands bactériens interagissant avec la plateforme CD9. Une fois ces ligands identifiés, ils seront inactivés par KO ou knockdown selon qu'ils sont essentiels ou non, et des analyses phénotypiques permettront de mesurer l'impact de cette inactivation sur l'adhésion, l'internalisation et la survie bactérienne. Les protéines cibles seront également exprimées en recombinantes afin de mesurer la force d'interaction avec CD9 et, dans le cas où la protéine bactérienne s'avère être une enzyme, elle sera étudiée biochimiquement, avec la possibilité de criblage pour identifier des inhibiteurs potentiels. Cette approche intégrée combinera biologie cellulaire, microbiologie et biochimie pour élucider les mécanismes moléculaires exploités par M. abscessus pour infecter les macrophages et identifier des cibles thérapeutiques.

Le projet combinera des approches de microbiologie, de biologie cellulaire et de biochimie pour étudier le rôle de CD9 dans l'adhésion, l'internalisation et la survie de Mycobacterium abscessus dans les cellules THP-1. La bactérie sera cultivée en phase exponentielle dans des milieux Middlebrook 7H9/7H10, préparée et homogénéisée pour garantir une infection uniforme, tandis que les cellules THP-1 seront différenciées en macrophages adhérents à l'aide de PMA. Une lignée THP-1 déficiente en CD9 sera générée par CRISPR/Cas9 et validée par immunofluorescence et Western blot, puis utilisée dans des tests d'adhésion, d'internalisation et de survie bactérienne, incluant des expériences de blocage avec des peptides dérivés de CD9. La dynamique spatiale de CD9 et sa colocalisation avec les bactéries seront suivies en temps réel par microscopie STED sur des cellules exprimant eGFP-CD9 et infectées par des bactéries fluorescentes. Les ligands bactériens interagissant avec CD9 seront identifiés par immunoprécipitation ou GFP-trap pull-down et analysés par SDS-PAGE et spectrométrie de masse, puis inactivés par KO (double recombinaison homologue) ou knockdown (tetOFF ou CRISPRi) selon leur caractère essentiel, et leur rôle dans l'infection évalué par des analyses phénotypiques (adhésion, internalisation, CFUs à court et long termes). Pour caractériser les interactions moléculaires, les protéines CD9 et les ligands bactériens seront produites en protéines recombinantes afin de mesurer la force de liaison, et, si le ligand est une enzyme, son activité sera étudiée biochimiquement, incluant purification des protéines et essais enzymatiques. Des criblages de banques d'inhibiteurs seront également réalisés pour identifier des molécules bloquant l'enzyme essentielle, avec validation par 'thermal shift assay', suivie de tests de survie bactérienne pour déterminer la concentration minimale inhibitrice in vitro. L'efficacité des composés sera ensuite évaluée in cellulo (THP-1) et in vivo, dans des modèles murins ou de poisson-zèbre, fournissant ainsi des pistes pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes.

Le candidat doit être titulaire d'un Master 2 ou d'un diplôme équivalent (ingénieur, pharmacien ou médecin). Des connaissances solides en biologie moléculaire et cellulaire sont requises, et une première expérience en microbiologie, culture cellulaire ou manipulation de pathogènes opportunistes sera un atout. Le profil idéal possède également des compétences en analyse de données expérimentales, rigueur scientifique, autonomie dans le travail, et capacité à communiquer efficacement ses résultats à l'oral comme à l'écrit.